基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy 第 二 十 一 章 基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy

基因(gene) 基因是为生物活性产物编码的DNA功能片断，这些产物主要是蛋白质或各种RNA。

基因变异致病类型 内源基因的变异 基因结构突变 基因表达异常 外源基因的入侵

第 一 节 基因诊断 Gene Diagnosis

一、基因诊断的概念和特点 （一）、定义 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 （二）、分类 DNA诊断—以DNA为检测对象的诊断方法。 RNA诊断—以mRNA为检测对象的诊断方法。

（三）、特点 针对性强 特异性高 灵敏度高 适用性强，诊断范围广

二、 基因诊断常用技术方法 （一）、核酸分子杂交技术 （二）、聚合酶链反应 （三）、基因测序 （四）、基因芯片 （五）、DNA指纹

（一）、核酸分子杂交(molecular hybridization)技术 核酸分子杂交可用以检测样本中是否存在与探针序列互补的同源核酸序列。 核酸探针 是一类具有放射性标记或化学标记的并与目的目的DNA或RNA分子序列互补的寡核苷酸片段。

探针是能够同某种待研究的核酸序列或蛋白多肽链特异结合的任何分子，经标记之后可用来检测目的DNA/RNA 或蛋白质分子。

建立在核酸杂交技术基础上的常用基因诊断方法 1、限制性内切酶(restriction endonuclease)酶谱分析法 2、DNA限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析法 3、等位基因特异寡核苷酸 (allele specific oligonucleotide, ASO)探针杂交法

1、限制性内切酶酶谱分析法 是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异的一种方法。

× 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 MstⅡ酶切位点(CCTNAGG) A→T 正常基因 突变基因 5´ 3´ 1.15kb 5´

镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 + ﹣ 1.35kb 1.15kb 0.2kb 正常人 突变携带着 患者

2、DNA-RFLP分析法 中性突变是指在人基因组中，平均每200对碱基可发生一对变异的现象。 限制性片段长度多态性是指DNA多态性若发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段。

RFLP分析法

3、ASO杂交法 根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于正常和突变基因碱基序列的两种寡核苷酸探针，用它们分别与受检者DNA进行分子杂交来检测是否存在等位基因突变。

ASO杂交法 + ﹣ 探针：M N M N M N M N 正常基因 纯合突变 杂合突变 基因缺陷 （新的突变类型？）

（二）、聚合酶链反应 (polymerase chain reaction, PCR) 是利用特异的引物，特异地扩增目的DNA的方法。 实验流程：提取DNA→PCR→凝胶电泳→显色→分析

1、基本工作原理 Template DNA Primer 1 5 5 Primer 2 Cycle 1 Cycle 2 5 5 5

25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。 Cycle 3 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 25～30 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。

2、常用的PCR方法： 常规PCR、巢式PCR、多重PCR、多种PCR、不对称PCR、反转录PCR、定量反转录PCR、mRNA差异显示PCR、原位PCR、实时PCR等等。

PCR-STR（短串联重复序列，short tandem repeat） PCR-SSCP法* PCR-ASO法 PCR-RFLP法 PCR-限制酶谱法 PCR-STR（短串联重复序列，short tandem repeat）

单链构象多态性 (single strand conformation polymorphism, SSCP) SSCP是指相同长度的单链DNA因其碱基序列不同，甚至单个碱基不同，都可能形成不同的空间构象，从而在中性聚丙烯酰胺凝胶电泳时泳动速率不同的现象。

PCR-SSCP分析 是指PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。

﹣ + 正常人 纯合突变 杂合突变 Leber 遗传性神经病患者 PCR/SSCP分析 （线粒体DNA第11778位G→A所致）

（三）、基因测序(gene sequencing) 即测定某一基因的碱基序列。 实验流程：提取DNA→分离出有关基因→测序→分析诊断 基因测序的方法： 化学裂解法 DNA链末端合成终止法 DNA自动测序

（四）、基因芯片（gene chip) 基因芯片，又称DNA芯片、DNA阵列、寡核苷酸微芯片（DNA chip、DNA arrays、oligonucleotide micro-chip）—是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出定性和定量的结果。

基因芯片的应用 1、在诊断中的应用 核酸序列分析、基因表达分析、寻找新基因、突变基因和基因多态性检测等 2、在药学研究中的应用 药物筛选、药物作用机制研究、耐药菌株、药敏检测、毒理学研究、环境化学毒物的筛选、基因扫描等

（五）、DNA指纹(DNA fingerprint) 在人基因组DNA中有高度可变的“小卫星”区域，采用“小卫星”基因探针，在同一限制酶切产物的DNA杂交图谱上，同一个体不同组织来源的DNA的谱带完全一致，而不同个体之间（同卵双生除外）谱带都不相同，如同人的指纹具有高度个体特异性一样，因此这种杂交图谱被称为DNA指纹或遗传指纹（genetic fingerprint）。

简言之：DNA指纹或遗传指纹是指采用“小卫星”基因探针进行DNA分子杂交（ Southern 印迹，Southern blotting）所得的图谱。

三、基因诊断的应用 遗传疾病 肿瘤 感染性疾病 传染性流行病 判断个体疾病易感性 器官移植组织配型 法医学中个体识别、亲子鉴定

总结 基因诊断的概念、特点、常用的技术方法及应用。

复习题 1、名词解释： 基因诊断、DNA诊断、RNA诊断、 RFLP分析、SSCP、基因芯片、DNA指纹 2、简述基因诊断的特点、常用技术方法及可用于诊断的疾病。简述基因变异致病的类型及内源性基因变异的类型。简述限制性内切酶谱分析法、ASO探针杂交法、PCR-SSCP分析、基因芯片、DNA指纹等的实验流程。

第 二 节 基因治疗 Gene Therapy

一、基因治疗的概念 （一）、基因治疗的概念 早期是指用正常的基因整合入细胞基因组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。

（二）、基因治疗的基本方法 1、基因矫正 (gene correction) 2、基因置换 (gene replacement) 3、基因增补 (gene augmentation) 4、基因失活 (gene inactivation)

1、基因矫正 (gene correction) 指将致病基因的异常碱基进行纠正，而正常部分予以保留。 纳米钳

A G C T G T G A A G T C G T G T C G A C A C T T C A G C A C C G T A abnormal gene normal gene Gene correction

2、基因置换 (gene replacement) 指用正常的基因通过体内基因同源重组，原位替换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。

A G C T G T G C A A G T C G T G T C G A C A C G T T C A G C A C normal gene A G C T G T G T A A G T C G T G T C G A C A C A T T C A G C A C abnormal gene A G C T G T G C A A G T C G T G T C G A C A C G T T C A G C A C normal gene Gene replacement

3、基因增补 (gene augmentation) 将目的基因导入病变细胞或其他细胞，不去除异常基因，而是通过目的基因的非定点整合，使其表达产物弥补缺陷基因的功能或使原有基因表达增强。

A G C T G T G T A A G T C G T G T C G A C A C A T T C A G C A C abnormal gene A G C T G T G C A A G T C G T G T C G A C A C G T T C A G C A C normal gene Gene augmentation

4、基因失活 (gene inactivation) 指将特定的序列导入细胞后，在转录或翻译水平阻断某些基因的异常表达，已达到治疗疾病的目的。

几种常见的基因失活技术 反义核酸技术 核酶技术 三链技术 干扰RNA技术 肽核酸 基因敲除

①反义(antisence)核酸技术 是指用人工合成的RNA或DNA来阻断基因的转录或复制，使编码基因不能转录为mRNA，因而不能翻译成相应的蛋白质。

反义RNA技术 反义RNA是指与mRNA互补，且能抑制与疾病发生直接相关基因表达的RNA。

Gene inactivation T C G A C A C A T T C A G C A C A G C T G T G T A A G T C G T G abnormal gene abnormal mRNA U C G A C A C A U U C A G C A C 反义RNA A G C U G U G U A A G U C G U G Abnormal protein Abnormal protein Gene inactivation

②核酶(ribozyme)技术 通过核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头核酶结构，催化对靶RNA分子的剪切，从而破坏靶RNA分子达到治疗疾病的目的。

核酶分子 3’ 5’ 靶RNA 5’ 3’ 核酶技术

③三链技术(triplex approach) 又称为反基因策略(antigene stragegy)，是利用脱氧寡核苷酸能与双螺旋双链DNA专一性序列结合，形成三链DNA，从而在转录水平或复制水平阻止基因转录或复制的技术。 能形成三链DNA的脱氧寡核苷酸称为三链DNA形成脱氧寡核苷酸（triplex-forming oligonucleotide,TFO)。

三链DNA技术 复制、转录

④干扰RNA(interference RNA,RNAi)技术 RNAi是指在特定因子作用下，有导入胞内的双链RNA降解生成的约22nt左右的SiRNAs(single strand RNAi)。 RNAi技术是指利用碱基互补配对原则，使RNAi和靶DNA结合，同时诱导激活体内的基因沉默因子，从而使靶DNA降解。

dsRNA RNAi RNAi-DNA RNA、DNA降解 干扰RNA技术

RNAi技术的特点 特异性强 效率性高 作用时间长 可通过细胞屏障而发挥作用

⑤肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)技术 PNA是指DNA-肽复合物。 PNA技术是利用多肽与DNA的特异性结合，专一地抑制某一基因的表达。

肽 肽核酸技术

⑥基因敲除(gene knock-out)技术 指有目的的去除动物体内某种基因的技术。

（三）、基因治疗的其他方法 1、“自杀基因”的应用 某些病毒或细菌的基因所表达的酶能将对人体无毒或低毒的药物前体在人体细胞内转变为细胞毒性产物，从而导致携带该基因的受体细胞也被杀死，故称这类基因为自杀基因。 自杀基因 无毒、低毒的药物前体→ → → 细胞毒性产物→细胞死亡

2、基因疫苗的应用 将编码外源性抗原的基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞内表达抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。

外源性抗原基因 重组表达质粒 基因疫苗

二、基因治疗的基本程序 一、治疗性基因的选择 目的基因的选择 二、基因载体的选择 病毒载体** 非病毒载体 三、靶细胞的选择 体细胞 一、治疗性基因的选择 目的基因的选择 二、基因载体的选择 病毒载体** 非病毒载体 三、靶细胞的选择 体细胞 生殖细胞 四、基因转移 间接体内疗法(ex vivo) 直接体内疗法(in vivo) 五、外源基因表达的筛选 利用载体中的标记基因 有neor标记基因时，用 418进行筛选 六、回输体内 静脉回输 自体骨髓移植 埋入皮下组织

常见基因载体的优缺点 载体 优点 缺点 逆转录病毒 基因组小并且简单 仅感染分裂细胞 稳定整合于宿主基因组 随机整合可能导致突变 生物学特性清楚 常常只有短暂表达 可高效转入复制中的细胞 病毒滴度低107pfu/ml 对宿主无害 可能会于有复制能力的病毒重组 腺病毒相关病毒 基因组小 未知 可特异整合于人染色体19q 需腺病毒辅助复制 以人细胞作为宿主 携带外源基因能力有限 无毒，无致病性 难得到高滴度病毒

载体 优点 缺点 腺病毒 适用于原位使用，尤其是肺 不与宿主基因整合 在不分裂细胞中可进行高效率 只有短暂表达 的体内感染 无特异性靶细胞 载体 优点 缺点 腺病毒 适用于原位使用，尤其是肺 不与宿主基因整合 在不分裂细胞中可进行高效率 只有短暂表达 的体内感染 无特异性靶细胞 病毒滴度高1010pfu/ml 病毒蛋白可引起免疫反应和炎症反应 生物学特性清楚 插入外源基因能力有限 脂质体 无感染能力 无特异性靶细胞 理论上无DNA大小限制 转染效率低 毒性低 仅有短暂表达，体内应用困难 受体介导的转运 无感染能力 转染效率低 特异性转染靶细胞 体内应用困难 理论上无DNA大小限制 可能有免疫原性 构建灵活 只有短暂表达

三、基因治疗的应用与展望 (一）、应用 遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、感染性疾病、神经系统疾病 基因治疗研究的病种应该符合的条件 1、是单基因缺陷病 2、是体细胞病 3、靶细胞易获取、培养、操作、回输 4、治疗效果甚于危害 5、无需严格的表达水平调控 6、动物实验证明符合严格的安全标准

(二)、展望 进一步寻找切实有效的基因 精密调控外源基因在人体内的表达 构建安全、高效、靶向、可控载体 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响

本节重点提示 基因治疗的概念、方法、基本程序

复习题 1、名词解释 基因治疗、基因矫正、基因置换、基因增补、基因失活、反义核酸技术、反义RNA技术、核酶技术、三链技术、干扰RNA技术、反义RNA、干扰RNA、自杀基因 2、简述基因治疗的间接体内疗法的基本程序；基因载体的类型、靶细胞的类型、基因转移的方法