第6章 吸光光度法 Spectrophotometry 6.1 概述 6.2 光度分析法的设计 6.3 光度分析法的误差 6.4 其他吸光光度法及光度分析法的应用

7.1 概述 1 吸光光度法的特点 2 光吸收的基本定律 3 比色法和吸光光度法及其仪器

6.1.1 吸光光度法的特点 1 定义：吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法，包括比色法、可见及紫外吸光光度法及红外光谱法等。我们重点讨论可见光区的吸光光度法。

1.光的基本性质

2. 吸收光谱产生的原理 * 吸收光谱分为：原子吸收光谱和分子吸收光谱。是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。 * 原子吸收光谱 * 吸收光谱分为：原子吸收光谱和分子吸收光谱。是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。 * 原子吸收光谱 Atomic absorption spectrum 由原子外层电子选择性地吸收某些波 长的电磁波而引起的，为线状光谱。 线状光谱 - Line spectrum

→由电子能级跃迁而产生吸收光谱[能量差在1~20(eV)]，是紫外及可见分光光度法。 * 分子吸收光谱 -带状光谱 molecular absorption spectrum →由电子能级跃迁而产生吸收光谱[能量差在1~20(eV)]，是紫外及可见分光光度法。 UV/Vis Spectrophotometry → 由分子振动能级(能量差约0.05~l eV)和转动能级(能量差小于0.05 eV)的跃迁而产生的吸收光谱，为红外吸收光谱。用于分子结构的研究。 Infrared Spectrophotometry →带状光谱 Band spectrum

* 单色光（monochromatic light）：具同一波长的光。 * 复合光（multiplex light）：由不同波长组成的光。 * 紫外光（ultraviolet light）：波长200~400 nm。 * 可见光（visible light）：人眼能感觉到的光，波长在400~750 nm。它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的 * 波段（wave band）：各种色光的波长范围不同。 * 互补色光（complementary color light）：按一定比例混合，得到白光（white light）。 * 物质的颜色是因物质对不同波长的光具有选择性吸收作用而产生的。

* 吸收光谱曲线或光吸收曲线（ absorption curve）：以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。 * 最大吸收波长（maximum absorption wavelengh ）：光吸收程度最大处的波长，用λmax表示 * 吸光度（absorbance） 在可见光，KMnO4溶液 对波长525 nm附近绿色光 的吸收最强，而对紫色和 红色的吸收很弱。λmax= 525 nm。浓度不同时， 光吸收曲线形状相同， λmax不变，吸光度不同。

a 灵敏度高。常用于测定试样中质量分数为1%~10-5的微量组分，甚至可测定低至质量分数为10-6~10-8的痕量组分。 3.目视比色法(colorimetry)和吸光光度法的特点 a 灵敏度高。常用于测定试样中质量分数为1%~10-5的微量组分，甚至可测定低至质量分数为10-6~10-8的痕量组分。 b 准确度较高。目视比色法的相对误差为5%~10%，吸光光度法为2%~5%。 c 应用广泛。几乎所有的无机离子和许多有机化合物都可以直接或间接地用目视比色法或吸光光度法进行测定。 d 仪器简单、操作简便、快速。

6.1.2 光吸收的基本定律 1. 朗伯-比尔定律 （Lambert-Beer law） 当一束平行单色光通过任何均匀、非散射的固体、液体或气体介质时，一部分被吸收，一部分透过介质，一部分被器皿的表面反射。如图6-3所示，设人射光强度为I'0，吸收光强度为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir。

在吸光光度分析法中，试液和空白溶液分别置于同样质料及厚度的吸收池中，然后让强度为I‘0的单色光分别通过这两个吸收池，再测量其透过光的强度。此时反射光强度基本上是不变的，且其影响可以相互抵消。

透射比或透光度 （Transmittance） 透过光强度It与人射光强度Io之比称为透射比或透光度，用T表示溶液的透射比愈大，表示它对光的吸收愈小;相反，透射比愈小，表示它对光的吸收愈大。

朗伯(Lambert J H)和比尔(Beer A)分别 于1760和1852年研究了光的吸收与溶液层的 厚度及溶液浓度的定量关系，二者结合称为 朗伯-比尔定律，也称为光的吸收定律。 当一束强度为I0的平行单色光垂直照射到长 度为b的液层、浓度为c的溶液时，由于溶液 中吸光质点(分子或离子)的吸收，通过溶液后 光的强度减弱为I：

* 朗伯-比尔定律表明：当一束单色光通过含有吸光物质的溶液后，溶液的吸光度与吸光物质的浓度及吸收层厚度成正比。这是进行定量分析的理论基础。比例常数K与吸光物质的性质、入射光波长及温度等因素有关。 * 含有多种吸光物质的溶液，由于各吸光物质对某一波长的单色光均有吸收作用，若各吸光物质的吸光质点之间相互不发生化学反应，当某一波长的单色光通过这样一种含有多种吸光物质的溶液时，溶液的总吸光度应等于各吸光物质的吸光度之和。这一规律称吸光度的加和性。

2. 摩尔吸收系数和桑德尔灵敏度 * 摩尔吸收系数 molar absorptivity 当浓度c用mol·L-1，液层厚度b用cm为单位表示，则K用另一符号ε来表示。ε称为摩尔吸收系数，单位为L·mol-l·m-1，它表示物质的量浓度为l mol·L-1，液层厚度为l cm时溶液的吸光度。

桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数) S来表示。S是指当仪器的检测极限A=0 * 桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数) S来表示。S是指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为μg·cm-2，S与ε及吸光物质摩尔质量M的关系为：

6.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器 1. 目视比色法 colorimetry 6.1.3 比色法和吸光光度法及其仪器 1. 目视比色法 colorimetry 用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。优点是仪器简单，操作简便，适宜于大批试样的分析。灵敏度高，因为是在复合光-白光下进行测定，故某些显色反应不符合朗伯-比尔定律时，仍可用该法进行测定。主要缺点是准确度不高，标准系列不能久存，需要在测定时临时配制。

2 吸光光度法 Spectrophotometry 借助分光光度计来测量一系列标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，根据被测试液的吸光度，从标准曲线上求得被测物质的浓度或含量。 Standard curve- calibrated curve- working curve 吸光光度法与目视比色法在原理上不同。吸光光度法是比较有色溶液对某一波长光的吸收情况，目视比色法则是比较透过光的强度。例如，测KMnO4的含量，吸光光度法测量的是KMnO4溶液对黄绿色光的吸收情况，目视比色法则是比较KMnO4溶液透过红紫色光的强度。

*吸光光度法特点：入射光是纯度较高的单色光，故便偏离朗伯-比尔定律的情况大为减少，标准曲线直线部分的范围更大，分析结果的准确度较高。因可任意选取某种波长的单色光，故利用吸光度的加和性，同时测定溶液中两种或两种以上的组分。由于入射光的波长范围扩大了，许多无色物质，只要它们在紫外或红外光区域内有吸收峰，都可以测定。

3. 分光光度计及其基本部件 分光光度计按工作波长范围分类，紫外、可见分光光度计应用于无机物和有机物含量的测定，红外分光光度计主要用于结构分析。分光光度计又可分为单光束和双光束两类。722型分光光度计是数字显示的单光束、可见分光光度计（recording spectrophotometer）。 旧的光电比色计 （ photoelectric colorimeter） 分光光度计的基本部件:光源、单色器、比色皿、检测器和显示装置。

hydrogen deuterium tungsten mercury lamp lamp lamp lamp a.光源 （light source） 用6~12 V钨丝灯作可见光区的光源，发出的连续光谱在360~800 nm 范围内。光源应该稳定，即要求电源电压保持稳定。为此，通常在仪器内同时配有电源稳压器。 氢灯 氘灯 钨灯 汞灯 hydrogen deuterium tungsten mercury lamp lamp lamp lamp

b. 单色器 monochromator 单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。分为棱镜和光栅。 棱镜（prism）：根据光的折射原理而将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过一个很窄的狭缝（slit）照射到吸收池上。由玻璃或石英制成。玻璃棱镜用于可见光范围，石英棱镜则在紫外和可见光范围均可使用。

光栅（grating）是根据光的衍射和干涉原理将复合光色散为不同波长的单色光，然后再让所需波长的光通过狭缝照射到吸收池上。它的分辨率比棱镜大，可用的波长范围也较宽。 滤光片（filter）

c. 比色皿(coloritrough) 也称吸收池。用于盛放试液的容器。 它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃制成的，按其厚度分为0.5 cm，l cm，2 cm，3 cm和5 cm。 在可见光区测量吸光度时使用玻璃吸收池， 紫外区则使用石英吸收池。使用比色皿时应注意保持清洁、透明，避免磨损透光面。

d.检测器 detector 接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。分为光电管和光电倍增管。 光电管 （phototube）：一个真空或充有少量惰性气体的二极管。阴极是金属做成的半圆筒，内侧涂有光敏物质，阳极为一金属丝。光电管依其对光敏感的波长范围不同分为红敏和紫敏两种。红敏光电管是在阴极表面涂银和氧化铯，适用波长范围为625~1000 nm;紫敏光电管是阴极表面涂锑和铯，适用波长范围为200~625 nm。

光电倍增管（photomultiplier） 由光电管改进而成的，管中有若千个称为倍增极的附加电极。可使光激发的电流得以放大，一个光子约产生106~107 个电子。它的灵敏度比光电管高200多倍。适用波长范围为160~700 nm。光电倍增管在现代的分光光度计中被广泛采用。 光电池 photocell

e.显示装置 作用是把放大的信号以吸光度A或透射比T的光度分析法的设计方式显示或记录下来。分光光度计常用的显示装置是检流计、微安表、数字显示记录仪。

6.2 光度分析法的设计 1 显色反应 2 显色条件的选择 3 测量波长和吸光度范围的选择 4 参比溶液的选择 5 标准曲线的制作

6.2.1显色反应（color reaction） 待测物质本身有较深的颜色，直接测定；待测物质是无色或很浅的颜色，需要选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称为显色剂 （color reagent）。 按显色反应的类型来分，主要有氧化还原反应和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。

（1） 显色反应的选择 A 选择性好，干扰少，或干扰容易消除;灵敏度高，有色物质的ε应大于104。 B 有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。 C 有色化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过程中溶液的吸光度基本恒定。这就要求有色化合物不容易受外界环境条件的影响。 D 有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要求两者的吸收峰波长之差Δλ(称为对比度)大于60 nm。

（2）显色剂 无机显色剂不多，因为生成的络合物不稳定，灵敏 度和选择性也不高。如用KSCN显色测铁、钼、钨和 铌；用钼酸铵显色测硅、磷和钒;用H2O2显色测钛等。 有机显色剂分子中含有生色团（chromophoric group）和助色团（auxochrome group）。生色团是 某些含不饱和键的基团，如偶氮基、对醌基和羰基等。 这些基团中的π电子被激发时需能量较小，可吸收波 长200 nm以上的可见光而显色。助色团是含孤对电 子的基团，如氨基、羟基和卤代基等。这些基团与生 色团上的不饱和键作用，使颜色加深。

F 铬天青S 三苯甲烷类显色剂，测定Al3+。 有机显色剂 A 磺基水杨酸 OO型螯合剂，可与很多高价金属离子生成稳定的螯合物，主要用于测Fe3+。 B 丁二酮肟 NN型螯合显色剂，用于测定Ni2+。 C 1，10-邻二氮菲 NN型螯合显色剂，测微量Fe2+。 D 二苯硫腙 含S显色剂，萃取光度测定Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+，Hg2+等。 E 偶氮胂Ⅲ(铀试剂Ⅲ) 偶氮类螯合剂，强酸性溶液中测Th(Ⅳ),Zr(Ⅳ)，U(Ⅳ)等；在弱酸性溶液中测稀土金属离子。 F 铬天青S 三苯甲烷类显色剂，测定Al3+。 G 结晶紫 三苯甲烷类碱性染料，测定Tl3+。

（3）多元络合物 多元络合物是由三种或三种以上的组分所形成的络合物。目前应用较多的是由一种金属离子与两种配位体所组成的三元络合物。三元络合物在吸光光度分析中应用较普遍。重要的三元络合物类型。 * 三元混配络合物 金属离子与一种络合剂形成未饱和络合物，然后与另一种络合剂结合，形成三元混合配位络合物，简称三元混配络合物。例如，V(V)，H2O2和吡啶偶氮间苯二酚(PAR)形成1:1:1的有色络合物，可用于钒的测定，其灵敏度高，选择性好。

* 离子缔合物 金属离子先与络合剂生成络阴离子或络阳离子，再与带反电荷的离子生成离子缔合物。主要用于萃取光度法。 如，Ag+与1，10-邻二氮菲形成阳离子，再与溴邻苯三酚红的阴离子形成深蓝色的离子缔合物。用F-、H2O2、EDTA作掩蔽剂，可测定微量Ag+。 作为离子缔合物的阳离子，有碱性染料、1，10-邻二氮菲及其衍生物、安替比林及其衍生物、氯化四苯砷(或磷、锑)等;作为阴离子，有X-，SCN-，ClO4-，无机杂多酸和某些酸性染料等。

* 金属离子-络合剂-表面活性剂体系 金属离子与显色剂反应时，加入某些表面活性剂，可以形成胶束化合物，它们的吸收峰向长波方向移动(红移)，而测定的灵敏度显著提高。目前，常用于这类反应的表面活性剂有溴化十六烷基吡啶、氯化十四烷基二甲基苄胺、氯化十六烷基三甲基铵、溴化十六烷基三甲基铵 、溴化羟基十二烷基三甲基铵、OP乳化剂。例如，稀土元素、二甲酚橙及溴化十六烷基吡啶反应，生成三元络合物，在pH 8~9时呈蓝紫色，用于痕量稀土元素总量的测定。

* 杂多酸 溶液在酸性的条件下，过量的钼酸盐与磷酸盐、硅酸盐、砷酸盐等含氧的阴离子作用生成杂多酸，作为吸光光度法测定相应的磷、硅、砷等元素的基础。杂多酸法需要还原反应的酸度范围较窄，必须严格控制反应条件。很多还原剂都可应用于杂多酸法中。氯化亚锡及某些有机还原剂，例1-氨基-2-萘酚-4-磺酸加亚硫酸盐和氢醌常用于磷的测定。硫酸肼在煮沸溶液中作砷钼酸盐和磷钼酸盐的还原剂。抗坏血酸也是较好的还原剂。

实验条件包括:溶液酸度，显色剂用量，试剂加入顺序，显色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。 6.2.2 显色条件的选择 实验条件包括:溶液酸度，显色剂用量，试剂加入顺序，显色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。 1. 溶液的酸度 M+HR===MR+H+ * 影响显色剂的平衡浓度和颜色 * 影响被测金属离子的存在状态 * 影响络合物的组成 * pH与吸光度关系曲线确定pH范围。

2. 显色剂的用量 M(被测组分)+R(显色剂) ==MR(有色络合物) 为使显色反应进行完全，需加入过量的显色剂。但显色剂不是越多越好。有些显色反应，显色剂加人太多，反而会引起副反应，对测定不利。在实际工作中根据实验结果来确定显色剂的用量。

3. 显色反应时间:有些显色反应瞬间完成，溶液颜色很快达到稳定状态，并在较长时间内保持不变;有些显色反应虽能迅速完成，但有色络合物的颜色很快开始褪色;有些显色反应进行缓慢，溶液颜色需经一段时间后才稳定。制作吸光度-时间曲线确定适宜时间。 4. 显色反应温度 ：显色反应大多在室温下进行。但是，有些显色反应必需加热至一定温度完成。 5. 溶剂：有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮颜色加深。还可能提高显色反应的速率，影响有色络合物的溶解度和组成等。

6. 干扰及其消除方法:试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。例如干扰物质本身有颜色或与显色剂反应，在测量条件下也有吸收，造成正干扰。干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，便显色反应不完全，也会造成干扰。干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无法准确测定溶液的吸光度。 为消除以上原因引起的干扰，可采取以下几种方法。

a. 控制溶液酸度 b.加入掩蔽剂 选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用，掩蔽剂以及它与干扰物质形成的络合物的颜色应不干扰待测离子的测定。 c.利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态 d.利用校正系数 e.用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。 f.选择适当的波长 g.当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。 h.分离 以上方法均不奏效时，采用预先分离的方法。

长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则” （maximum absorption）。选用这种波长的 光进行分析，不仅灵敏度高，且能减少或消 6.2.3 测量波长和吸光度范围的选择 1.测量波长的选择 为了使测定结果有较 高的灵敏度，应选择被测物质的最大吸收波 长的光作为入射光，这称为“最大吸收原则” （maximum absorption）。选用这种波长的 光进行分析，不仅灵敏度高，且能减少或消 除由非单色光引起的对朗伯-比尔定律的偏离。 但是，在最大吸收波长处有其他吸光物 质干扰测定时，则应根据入射光波长。

例 丁二酮肟光度法测钢中镍， 络合物丁二酮肟镍的最大吸收 波长为470 nm，但试样中的铁 用酒石酸钠掩蔽后，在470 nm 处也有一定吸收，干扰镍的测 定。为避免铁的干扰，可以选 择波长 520 nm进行测定，虽然 测镍的灵敏度有所降低，但酒 石酸铁不干扰镍的测定。

2. 吸光度范围的选择 从仪器测量误差的角度来看，为使测量结果得到较高的准确度，一般应控制标准溶液和被测试液的吸光度在0.2~0.8范围内。可通过控制溶液的浓度或选择不同厚度的吸收池来达到目的。

来的误差，扣除干扰的影响。参比溶液选择： a 试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。 6.2.4 参比溶液的选择 利用参比溶液来调节仪器的零点，可消除 由吸收池壁及溶剂对入射光的反射和吸收带 来的误差，扣除干扰的影响。参比溶液选择： a 试液及显色剂均无色，蒸馏水作参比溶液。 b 显色剂为无色，被测试液中存在其他有色离子，用不加显色剂的被测试液作参比溶液。 c 显色剂有颜色，可选择不加试样溶液的试剂空白作参比溶液。

d 显色剂和试液均有颜色，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂及其他试剂均按试液测定方法加入，以此作为参比溶液，这样就可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。 e 改变加入试剂的顺序，使被测组分不发生显色反应，可以此溶液作为参比溶液消除干扰。

6.2.5 标准曲线的制作 根据光的吸收定律:吸光度与吸光物质的含量成正比，这是光度法进行定量的基础，标准曲线就是根据这一原理制作的。具体方法为:在选择的实验条件下分别测量一系列不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到一条通过原点的直线，称为标准曲线，此时测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上就可以查到与之相对应的被测物质的含量。

* 有时标准曲线不通过原点。 可能是由于参比溶液选择不当， 吸收池厚度不等，吸收池位置 不妥，吸收池透光面不清洁等 原因所引起的。若有色络合物 的解离度较大，特别是当溶液 中还有其他络合剂时，常便被 测物质在低浓度时显色不完全。 找出原因，加以避免。

6.3 光度分析法的误差 1 对朗伯-比尔定律的偏离 2 吸光度测量的误差

在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线 6.3.1对朗伯-比尔定律的偏离 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线 的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到 通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种 情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行 定量，将会引起较大的误差。 偏离朗伯－比尔定律 的原因主要是仪器或溶液 的实际条件与朗伯-比尔定 律所要求的理想条件不一致。

1. 非单色光引起的偏离 * 朗伯-比尔定律只适用于单色光，但由于单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，所以目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯－比尔定律的偏离。

◎ 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围。 * 克服非单色光引起的偏离的措施 ◎ 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围。 ◎ 人射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的ε值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。 ◎ 测定时应选择适当的浓度范围，使吸光度读数在标准曲线的线性范围内。

2.介质不均匀引起的偏离 朗伯－比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀的。如果被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液后，除一部分被试液吸收外，还有一部分因散射现象而损失，使透射比减少，因而实测吸光度增加，便标准曲线偏离直线向吸光度轴弯曲。故在光度法中应避免溶液产生胶体或混浊。

3.由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯—比尔定律。 A 解离 大部分有机酸碱的酸式、碱式对光有不同的吸收性质，溶液的酸度不同，酸(碱)解离程度不同，导致酸式与碱式的比例改变，使溶液的吸光度发生改变。 B 络合 显色剂与金属离子生成的是多级络合物，且各级络合物对光的吸收性质不同，例如在Fe(Ⅲ)与SCN-的络合物中，Fe(SCN)3颜色最深，Fe(SCN)2+颜色最浅，故SCN-浓度越大，溶液颜色越深，即吸光度越大。

c 缔合 例如在酸性条件下，CrO42-会缔合生成Cr2O72-，而它们对光的吸收有很大的不同。 在分析测定中，要控制溶液的条件，使被测组分以一种形式存在，以克服化学因素所引起的对朗伯－比尔定律的偏离。

6.3.2 吸光度测量的误差 在吸光光度分析中，仪器测量不准确也是误差 的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这 些误差可能来源于光源不稳定，实验条件偶然变动， 读数不准确等。 在光度计中，透射比的标尺刻度均匀。吸光度标 尺刻度不均匀。对于同一仪器，读数的波动对透射 比为一定值；而对吸光度读数波动则不再为定值。 吸光度越大，读数波动所引起的吸光度误差也越大

透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大，即 光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两 端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间，或使吸光 度A在0.2~0.8之间，才能保证测量的相对误差较小。 当A=0.434(或透射比T=36.8%)时，测量的相对误 差最小。

6.4 其他吸光光度法及吸光光度法应用 1 示差吸光光度法 2 双波长吸光光度法 3 弱酸和弱碱解离常数的测定 4 络合物组成的测定

6.4.1 示差吸光光度法（differential） 1.示差吸光光度法的原理 吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待测定组分浓度过高或过低，会引起很大的测量误差，导致准确度降低。示差吸光光度法可克服这一缺点。目前，主要有高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸光光度法和使用两个参比溶液的精密示差吸光光度法。它们的基本原理相同，且以高浓度示差吸光光度法应用最多，仅介绍高浓度示差吸光光度法。

吸光度差与这两种溶液的浓度差成正比。以把 空白溶液作为参比的稀溶液的标准曲线作为ΔA和 Δc的标准曲线，根据测得的ΔA求出相应的Δc值， 从cx=co+c可求出待测试液的浓度，这就是示差吸 光光度法定量的基本原理。

2.示差吸光光度法的误差 Δc(即cx－co)，测量误差为x%， 结果为cx±(cx-co)×x%； 普通光度法的结果为cx±cx·x%。因cx只是稍大于co，故cx总是远大于Δc，故示差吸光光度法的准确度高。参比溶液的浓度越接近待测试液的浓度，测量误差越小，最小误差可达0.3%。

6.4.2 双波长吸光光度法（dual-wavelength） 1.双波长吸光光度法的原理 使两束不同波长的单色光以一定的时间间隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸光度的差值。这样就可以从分析波长的信号中扣除来自参比波长的信号，消除各种干扰，得待测组分的含量。分析方法的灵敏度、选择性及测量的精密度高。被广泛用于环境试样及生物试样的分析。

ΔA与吸光物质浓度成正比。这是定量的理论依 据。只用一个吸收池，以试液本身对某一波长的光 的吸光度为参比，消除了因试液与参比液及两个吸 收池之间的差异引起的测量误差，提高测量的准确度。

2.双波长吸光光度法的应用 * 混浊试液中组分测定 ：一般选择待测组分的最大吸收波长为测量波长(λl)，选择与其相近而两波长相差在40~60 nm范围内且有较大的ΔA值的波长为参比波长。 * 单组分的测定 ：进行单组分的测定，以络合物吸收峰作测量波长，参比波长的选择有：以等吸收点为参比波长; 以有色络合物吸收曲线下端的某一波长作为参比波长；以显色剂的吸收峰为参比波长。

* 两组分共存时的分别测定：当两种组分的吸收光谱有重叠时，要测定其中一个组分就必须消除另一组分的光吸收。对于相互干扰的双组分体系，它们的吸收光谱重叠，选择参比波长和测定波长的条件是:待测组分在两波长处的吸光度之差ΔA要足够大，干扰组分在两波长处的吸光度应相等，这样用双波长法测得的吸光度差只与待测组分的浓度成线性关系，与干扰组分无关，从而消除了干扰。

测定苯酚(X)与2，4，6-三氯苯酚(Y)混合物中的苯酚时就可用这种方法。当选择λ2为测量波长，三氯苯酚在此波长处也有较大吸收，产生干扰。选择波长λ1或λ1‘（等吸收点）作为参比波长，则可以消除三氯苯酚对苯酚测定的干扰。

6.4.3 弱酸和弱碱解离常数的测定 HB==H++B-

6.4.4 络合物组成的测定 固定一种组分(通常是金 1.饱和法(又称摩尔比法) 属离子M)的浓度，改变络合 剂(R)的浓度，得到一系列 [R]/[M]比值不同的溶液， 并配制相应的试剂空白作 参比液，分别测定其吸光度。 以吸光度A为纵坐标，[R]/[M]为横坐标作图。

cM+cR=c，改变cM和cR的相对量， 2.连续变化法(又称等摩尔系列法) cM+cR=c，改变cM和cR的相对量， 配制一系列溶液，在有色络合物 的最大吸收波长处测量这一系列 溶液的吸光度。当溶液中络合物 MRn浓度最大时，cR/cM比值为n。 当cM/c为0.5时，络合比为1:1； 当cM/c为0.33，络合比为1:2； 当cM/c=0.25时，络合比为1:3。

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