Dr. 潘志勇 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 zypan@mail.hzau.edu.cn 第六章 基因分离与克隆 Dr. 潘志勇 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室 zypan@mail.hzau.edu.cn

主要内容 第一节 基因的概念与发展历史 第二节 基因克隆操作 第三节 基因克隆的策略

第一节 基因的概念与发展历史 一、基因的本质 基因是遗传信息的基本单位 从物质结构上看，基因是染色体核酸分子 基因是作为遗传物质的核酸分子上的一段片段，可以是连续的，也可以是不连续的；可以是DNA也可以是RNA；可以存在于染色体上，也可存在于染色体之外（如质粒、噬菌体）

DNA -> RNA -> proteins Translation, occurs on ribosomes

二、基因的认识历程 1866，孟德尔 1910，摩根 1941，George Beadle一种基因一种酶—一种基因一种多肽链 1944，O.T. Avery细菌转化实验 1953，Watson-Crick DNA双链结构，中心法则

孟 德 尔 (1822-1884)

孟德尔（1822－1884）从 1856 年起开始豌豆试验。 孟德尔的基本方法是杂交。他挑选了七对性状。 经过近 10 年的潜心研究，孟德尔发表了他的研究报告。其内容可概括两个定律（分离定律和自由组合定律 ）。

孟德尔研究的七对性状 豌豆杂交操作

基因在染色体上 随着显微镜技术与染色技术的发展，人们注意到，细胞分裂时，尤其是减数分裂中，染色体的行为和孟德尔提出的等位基因的分离规律相当一致，所以，确定基因在细胞核中，在染色体上。

同一性状的两个等位基因 同源染色体分别带着控制 杂合子 显性等位基因 纯合子 隐性等位基因 纯合子

摩根 1866-1945

摩根实验室用果蝇为材料的工作，确定了基因在染色体上的分布规律。

果蝇有 4 对染色体

控制不同性状的等位基因 在2#染色体上的位置 野生果蝇没有现成的成对性状 摩根在长期饲养中找到各个性状的突变株。 触须 长/短 身体 灰/黑 眼睛 红/紫 翅 长/短 野生果蝇没有现成的成对性状 摩根在长期饲养中找到各个性状的突变株。

减数分裂时发生：染色体交叉/基因重组。

g－ 身体 c－ 眼睛 l－ 翅 基因重组服从这样的规则： 两个基因在染色体离得越远，重组频率越高； 灰/黑 c－ 眼睛 红/紫 l－ 翅 长/短 重 组 频 率 基因重组服从这样的规则： 两个基因在染色体离得越远，重组频率越高； 两个基因在染色体上离得越近，重组频率越低。

遗传物质是 DNA 随着生物化学的发展，蛋白质、核酸等生物大分子逐渐分离、纯化出来。各方面的实验证据表明，基因的化学本质不是蛋白质，而是 DNA。格里菲斯的实验证明遗传物质可以转化进入细菌，改变细菌特性。埃弗里的实验证实，进入细菌改变特性的遗传物质是 DNA，而不是蛋白质。

格里菲斯和埃弗里的肺炎双球杆菌转化实验

35S－ 标记蛋白质 32P－ 标记 DNA Alfed Hershey和Martha Chase(1952) 分别用放射性同位素标记噬菌体

35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞 32P 标记 DNA ,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞

1953年，沃森和克里克提出了DNA 双螺旋模结构和自我复制机制

在细胞分裂时，DNA 的合成应是“半保留复制”的模式。

细菌培养在含15N 的培养基 中 细菌培养在含14N 的培养基中 一代 两代 证实半保留复制的实验

DNA作为遗传物质的功能 （1）贮藏遗传信息的功能 （2）传递遗传信息的功能 （3）表达遗传信息的功能 由此，克里克提出中心法则, 确定遗传信息由 DNA 通过 RNA 流向蛋白质的普遍规律。

The Central Dogma 遗传信息储存在核酸中 遗传信息由核酸流向蛋白质 transcription replication translation DNA RNA Proteins Reverse transcription 遗传信息储存在核酸中 遗传信息由核酸流向蛋白质

三、基因的结构 1955 S. Benzen证明基因的最小突变单位和重组单位是DNA的一个碱基对。

基因的结构 编码区 ORF (Open Reading Frame) 启动子 Promoter 终止子 Terminator Flanking Sequence upstream/downstream Cap/Tail

基因的结构

四、克隆（clone） 无性繁殖 应用酶学的方法，在体外将目的基因（target gene)与载体（vector）DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)、重组体(recombinant），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝，或其表达产物。

五、基因工程 基因工程(genetic engineering)也叫基因操作、遗传工程，基因克隆、DNA克隆、分子克隆、 DNA重组或重组DNA技术。 它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另—种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖(称之为“克隆”)和行使正常功能(称之为“表达”)，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。

基因工程的理论依据 不同基因具有相同的物质基础。DNA DNA是可切割的。除少数基因重叠排列外，大多数基因彼此之间存在着间隔序列。 多肽与基因之间存在对应关系。 遗传密码是通用的。 基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。获得相对稳定的转基因生物。

基因工程的核心——基因操作 基因克隆示意图

基因工程发展历史 1973 Cohen第一例成功的克隆实验 1978 Genentech公司 人胰岛素 世界上第一种基因工程蛋白药物（商品化第一例，实际上第一例产品就促生长素抑制素somatostatin） 1982 第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 1985 第一批转基因家畜（兔、猪和羊），中国 转基因鱼

1956年 华盛顿大学 A.Kornberg利用大肠杆菌的细胞液，在体外合成了DNA，两年后分离出了DNA聚合酶。（Nobel Prize) 1972年Stanford大学的Paul Berg用EcoRI把猿猴空泡病毒和噬菌体的DNA切开，然后在这两种病毒的节开的DNA末端用末端转移酶加A和T，使这两个DNA在体外结合，再用DNA聚合酶补平缺口，最合用它们的连接点封闭成一头的重组DNA分子------

Paul Berg的方法非常繁琐，且重组的分子不易选择。 加州大学的Herbert Boyer与斯坦福的Stanlry Cohen）合作，用细菌的质粒作为载体，构建了重组DNA分子，并加上了抗生素基因。应用与上述类似的方法，把非洲蟾蜍的DNA同细菌质粒重组，并导入大肠杆菌细胞表达并转录出相应的mRNA产物。这就是第一次成功的基因克隆实验，说明了质粒分子是可以作为基因克隆的载体，真核动物的基因是可以被成功地转移到原核细胞中去，并实现其功能表达

1993 基因工程西红柿在美国上市 1997 英国罗斯林研究所 多莉羊 1999.9 中国获准加入人类基因组计划.负责测定人类基因组全部序列的1% 2000.6.26 科学家公布人类基因组工作草图 2001.2.11 公布人类基因组基本信息 2002 水稻基因组 2009 玉米基因组 2010 苹果基因组 2012 柑橘基因组 ……

基因工程研究的意义 如果说IT业改变的是 我们的生活方式，那么BT(Biotechnology生物产业)业改变的则是我们生命的方式。 我们将面临前所未有的机遇与挑战。 讨论：基因工程可能的应用方面 人类的梦想能否成真？

基因工程研究的意义 基础理论研究 加速进化，改造与创造物种 越来越多的产业加入到“用DNA编程” 的行列中来。农业、食品业、化工业、医药产业和畜牧业。

制药公司--------畜场 土地上种植的不仅有营养丰富的粮食和药物， 还有可降解的生物塑料 蔬菜水果可以当药 垃圾处理与废物变宝 能源植物 生物计算机 面对一块种满植物的土地，我们不知道它究竟是隶属于农业，医药 业，还是化学原材料业，或者是能源产业。事实上，这种区分也越来越没有意 义，因为大家都共同融入了世界上最大也是最重要的产业——生命科学产业。