重组DNA技术 及人类基因组研究

基因工程诞生的历史背景： 1973年是基因工程诞生的元年。 1. 1944年Oswald T.Avery等的肺炎球菌转化证明了DNA是遗传信息携带者。 2. 1953年James Watson和Francis Crick 两人提出了DNA结构的双螺旋模型，揭示了遗传物质自我复制的机制。 3. 1961-1965年,科学家破译了生物界全部64个遗传密码,发表了划时代的遗传密码字典，提出了遗传信息由DNA→RNA→蛋白质传递的中心法则。 4. 1970年发现了反转录酶，丰富了中心法则，为cDNA的制备奠定了基础。

5. 染色体外DNA----质粒的深入研究，为第一批重组DNA载体提供了材料。 6. 1968-1970年，限制性内切酶的发现和纯化，为DNA的体外重组提供了有力的工具。 7. 1972年，Berg.D等人首次用限制性内切酶EcoRI切割噬菌体和SV40病毒DNA分子，将这两种不同来源的DNA片段成功地在体外连接成杂合DNA分子。 至此，用重组DNA技术改变生物学性状的尝试在1973年由Cohen等人完成。从此，这项技术为生物学带来了一场深刻的革命，这类技术本身也迅速地发展起来，并广泛地渗透到各个学科的研究领域。

一、重组DNA技术相关概念 (一)DNA 克隆 克隆（clone）: 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化（cloning）,即无性繁殖。 技术水平： 分子克隆（molecular clone）：即DNA克隆 细胞克隆：个体克隆（动物或植物）

DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA连接成具有自我复制能力的DAN分子，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称为基因克隆或重组DNA

基因工程（genetic engineering）：实现基因克隆所用的方法及相关的工作称为基因工程，又称重组DNA工艺学 目的 a分离获得感兴趣的基因或DNA b获得感兴趣的基因表达产物

（二）重组DNA技术中常用的工具酶

限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶 分类：I, II, III类基因工程常用II类 作用:与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA

命名方式

II类酶识别序列特点 ５’ ３’ ３’ ５’ 　　限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别的核苷酸序列，呈二元旋转对称，通常将这种特殊的结构顺序称为回文结构（palindrome）。 识别序列可以是四核苷酸、六核苷酸或八核苷酸；产生的切口可以是粘性末端、平头或钝性末端、配伍末端。 。

５’ ５’ ５’ ３’ ３’ ３’ ５’ ５’ ３’ ３’

同功异源酶 来源不同的限制酶,能识别和切割同一位点,这些酶称为同功异源酶.

同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同,但切割DNA后会产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端成为配伍末端（compatible end)

(三)目的基因   目的基因：用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或DNA序列，又称目的DNA(target DNA)。 类型： cDNA(complementary DNA)：指经反转录合成的、与RNA互补的单链DNA，经聚合可合成双链cDNA。 基因组DNA(genetic DNA)：指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。

（四）基因载体 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子 载体选择标准 可转移性 合适的复制位点 多克隆位点：广泛、特异 选择标志，便于筛选和鉴定 分子较小，可容纳较大的外源DNA

常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA

克隆载体(cloning vector)：为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体成为克隆载体。 表达载体（expression vector)：为使插入的外源DNA序列可以转录翻译成多肽链而特意设计的载体成为表达载体。

质粒 能在宿主细胞内独立自主复制;带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状

二重组DNA技术基本原理

以质粒为载体的DNA克隆

（一）目的基因的获取 化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 基因组DNA库（genomic DNA library） cDNA文库(cDNA library) PCR反应

化学合成法获得目的基因

从基因组文库获取目的基因 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因DNA的集合

从cDNA文库获取目的基因

（二）克隆载体的选择和构建 载体容量 合适的克隆位点 载体的稳定性

(三）外源基因与载体的连接 粘性末端连接： 同一限制内切酶酶切点连接 不同限制内切酶酶切点连接 配伍末端和非配伍末端

同一内切酶酶切位点连接 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。

不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 + 重组体 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15ºC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。

平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端

载体 目的基因 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15ºC 重组体 载体自连 目的基因 自连

同聚体加尾部连接法 针对平性末端或者不匹配的末端 利用末端核酸转移酶在一个分子的末端加上poly(A);另一个分子3`末端加上poly(T)，通过DNA连接酶形成重组DNA分子。

人工合成接头连接法 人为的在目的基因的两端加上酶切位点，使得限制性内切酶酶切后与载体形成相同的粘性末端

（四）重组DNA导入受体菌 受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 导入方式 转化 转染 感染

重组体的筛选 直接选择法 抗药性标记选择 标志补救（marker rescue) 分子杂交（原为杂交，Southern 印机） 免疫学方法 免疫化学及酶免检测分析

标志补救

α互补的检测

原位杂交

Southern 杂交

（六）克隆基因的表达 　表达体系的建立 　　　表达载体的构建 　　　受体细胞的建立 　　　表达产物的分离纯化 　　１、原核表达体系 　　２、真核表达体系

重组ＤＮＡ技术与医学的关系 （一）生物制药

(二)基因诊断 基因诊断是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理,在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 基本过程

人类基因组

人类基因组及其组成 几个概念 基因组：一个单倍体细胞核中、一个细胞器中或一个病毒毒粒中所含有的全部DNA（或RNA）分子的总称。对于人类而言，核基因组即是指单倍体细胞核中整套染色体（22＋X＋Y）所具有的全部DNA分子。 基因组学（genomics):1986年最早提出，研究生物体的基因和基因组结构组成、不稳定性和功能的。分为结构基因组学和功能基因组学。

人类基因组的DNA序列 人类基因组总长约3.2X109bp 人类基因组中存在“热点”和大片“荒漠” 35.3%的基因组包含重复的序列 地球上人与人之间99.99%的基因密码是相同的，人与人之间的变异仅为万分之一 ？ ？

基因概念之演变 从遗传学史的角度看，基因概念大致分以下几个阶段： “基因”概念的提出、基因结构和功能的探索阶段、现代基因阶段。

“基因”概念的提出 19世纪60年代初，孟德尔表明生物的某种性状是由遗传因子负责传递的，遗传下来的不是具体的性状，而是遗传因子。遗传因子是颗粒性的，在体细胞内成双存在，在生殖细胞内成单存在。 孟德尔已经认识到了基因的两个基本属性：基因是世代相传的，基因是决定遗传性表达的。 1909年丹麦遗传学家约翰逊（W.Johansen 1859～1927）在《精密遗传学原理》一书中提出“基因”概念，以此来替代孟德尔假定的“遗传因子”。从此，“基因”一词一直伴随着遗传学发展至今。

基因结构和功能的探索 基因本质 1909年，丹麦遗传学家约翰逊创造了“基因”这一术语，用来表达孟德尔的遗传因子，但还只是提出了遗传因子的符号。摩尔根对果蝇的研究结果表明，1条染色体上有很多基因，一些性状的遗传行为之所以不符合孟德尔的独立分配定律，就是因为代表这些性状的基因位于同一条染色体上，彼此连锁而不易分离。这样，基因不再是抽象的符号，而是在染色体上占有一定空间的实体，从而赋予基因以物质的内涵。

1941年比德尔（G. W. Beadle 1903～）和塔特姆（E. L 1941年比德尔（G.W. Beadle 1903～）和塔特姆（E.L. Tatum 1909～1975）提出一个基因一个酶学说，证明基因通过它所控制的酶决定着代谢中生化反应步骤，进而决定生物性状。 1953年美国分子生物学家沃森（J.D. Watson）和英国分子生物学家克里克（F.H.C. Crick）通力协作，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，进一步说明基因成分就是DNA，它控制着蛋白质合成。

遗传物质传递 从1961年开始，尼伦伯格（M.W. Nirenberg）和科拉纳（H.G. Khorana）等人逐步搞清了基因以核苷酸三联体为一组编码氨基酸，并在1967年破译了全部64个遗传密码，这样把核酸密码和蛋白质合成联系起来。然后，沃森和克里克等人提出的“中心法则”更加明确地揭示了生命活动的基本过程。1970年特明（H.M. Temin）以在劳斯肉瘤病毒内发现逆转录酶这一成就进一步发展和完善了“中心法则”，至此，遗传信息传递的过程已较清晰地展示在人们的眼前。

基因功能 过去人们对基因的功能理解是单一的即作为蛋白质合成的模板。但是1961年法国雅各布（F. Jacob）和莫诺（J.L. Monod）提出了操纵子学说，大大扩大了人们关于基因功能的视野。

现代基因阶段 基因具重叠性 内含子和外显子　 管家基因和奢侈基因 基因的游动性

基因外DNA 大多数基因外DNA序列是以单一或低拷贝形式存在；其余是中度或高度重复序列，分为分散重复序列和串联重复序列（簇状重复序列） 中度重复序列：重复次数为101~105。

分散重复序列 一般属于中度重复序列，以分散的方式存在于基因组中，按照重复单元的长度可分为： 长分散重复序列（long interspersed nuclear element， LINE）,大于1000bp； 短分散重复序列（short interspersed nuclear element, SINE),100-300bp

串联重复序列 首尾相连成长串联状的重复序列，根据核心顺序的长短分为大卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。

卫星DNA DNA分子之间存在浮力密度的差异，在氯化铯密度梯度离心将会沉降于不同的位置。 DNA的浮力密度（ρ）与其G-C含量存在关系：ρ=1.660+0.00098(G-C%)。 因此经过密度梯度离心，高度重复序列DNA可以在基因组DNA的主带旁形成一条或多条小带，这取决于其G-C含量及重复程度，故又称为卫星DNA或随机DNA。

大卫星DNA（macrosatellite DNA) 又称为经典DNA。总长度100kb~几个Mb。根据浮力密度的不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和α、β卫星DNA。各类型都由不同的重复顺序家族组成

小卫星DNA（ minisatellite DNA) 由中等大小 的串联重复序列构成，总长约0.1~20kb，分布在所有染色体，往往近于端粒处。

微卫星DNA（microsatellite DNA) 重复单位为1~5 bp, 重复次数为10~60次，总长度小于150bp，常见以(AC)n和(TG)n二聚核苷酸为重复单位，由Miesfeld 1981年发现。

人类基因组计划 人类基因组计划是美国科学家于１９８５年率先提出的，旨在阐明人类基因组３０亿个碱基对的序列，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置，破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。计划于１９９０年正式启动，这一价值３０亿美元的计划的目标是，为３０亿个碱基对构成的人类基因组精确测序，从而最终弄清楚每种基因制造的蛋白质及其作用。

1984年在Utah州的Alta,White R and Mendelsonhn M受美国能源部(DOE）的委托主持召开了一个小型专业会议讨论测定人类整个基因组的DNA序列的意义和前景（Cook Deegan RM,1989） 1985年5月在加州Santa Cruz由美国DOE的Sinsheimer RL主持的会议上提出了测定人类基因组全序列的动议，形成了美国能源部的“人类基因组计划”草案。 1986年3月，在新墨西哥州的Santa Fe讨论了这一计划的可行性，随后DOE宣布实施这一计划。 1986年遗传学家McKusick V提出从整个基因组的层次研究遗传的科学称为“基因组学” 1987年初，美国能源部和国立卫生研究院为HGP下拨了启动经费约550万美元（全年1.66亿美元） 1988年，美国成立了“国家人类基因组研究中心”由Watson 出任第一任主任 1990年10月1日，经美国国会批准美国HGP正式启动，总体计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因组的分析。

1987年，意大利共和国国家研究委员会开始HGP研究1989年2月英国开始HGP 1990年6月欧共体通过了“欧洲人类基因组研究计划”，主要资助23个实验室重点用于“资源中心”的建立和运转。 1994年，我国HGP先后启动了“中华民族基因组中若干位点基因结构的研究”和“重大疾病相关基因的定位、克隆、结构和功能研究”，1998年在国家科技部的领导和牵线下，1998年在上海成立了南方基因中心，1999年在北京成立了北方人类基因组中心，1998年，组建了中科院遗传所。1999年7月在国际人类基因组注册，得到完成人类3号染色体短臂上一个约30Mb区域的测序任务，该区域约占人类整个基因组的1％。

HGP的研究内容 遗传图谱（genetic map） 物理图谱（physical map） 序列图谱 基因图谱

遗传图谱（genetic map） 又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造了条件。意义：6000多个遗传标记已经能够把人的基因组分成6000多个区域，使得连锁分析法可以找到某一致病的或表现型的基因与某一标记邻近（紧密连锁）的证据，这样可把这一基因定位于这一已知区域，再对基因进行分离和研究。对于疾病而言，找基因和分析基因是个关键。

物理图谱（physical map） 物理图谱描绘DNA 上可以识别的标记的位置和相互之间的距离( 以碱基对的数目为衡量单位) ，这些可以识别的标记包括限制性内切核酸酶的酶切位点，基因等。绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。 ?

序列图谱 随着遗传图谱和物理图谱的完成，测序就成为重中之重的工作。DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱。 大规模测序基本策略: 逐个克隆法：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）。 全基因组鸟枪法：在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装（美国Celera公司）。  

基因图谱 基因图谱是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。在人类基因组中鉴别出占具2%~5%长度的全部基因的位置、结构与功能，最主要的方法是通过基因的表达产物mRNA反追到染色体的位置。 基因图谱的意义：在于它能有效地反应在正常或受控条件中表达的全基因的时空图。通过这张图可以了解某一基因在不同时间不同组织、不同水平的表达；也可以了解一种组织中不同时间、不同基因中不同水平的表达，还可以了解某一特定时间、不同组织中的不同基因不同水平的表达。

HGP对人类的重要意义 HGP对人类疾病基因研究的贡献 HGP对医学的贡献 HGP对生物技术的贡献 HGP对制药工业的贡献

HGP对人类疾病基因研究的贡献 90年代之前，绝大多数人类遗传性疾病的生化基础都还不为人所知，无法用“表型－蛋白质－基因”的传统途径进行研究。在人类基因组的遗传作图和物理作图带动下，出现了“定位克隆”的全新思路，一大批重要疾病的基因被发现，为这些疾病的基因诊断和未来的基因治疗奠定了基础。随着人类基因组序列工作草图的问世，所有人类基因将会精确地定位于染色体的各个区域，一旦某个疾病位点被定位，即可从局部的序列图中遴选出结构、功能相关的基因进行分析，这就是“定位候选基因”的策略。

HGP对医学的贡献 基因诊断、基因治疗和基于基因组知识的治疗、基于基因组信息的疾病预防、疾病易感基因的识别、风险人群生活方式、环境因子的干预。

人类基因组物理图谱在人类基因克隆研究中的应用 （引自 陈竺等：基因组科学与人类疾病，2001）

HGP对生物技术的贡献 基因工程药物：分泌蛋白（多肽激素，生长因子，趋化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受体。 诊断和研究试剂产业：基因和抗体试剂盒、诊断和研究用生物芯片、疾病和筛药模型。 对细胞、胚胎、组织工程的推动：胚胎和成年期干细胞、克隆技术、器官再造。

HGP对制药工业的贡献 筛选药物的靶点 药物设计

HGP对社会经济的重要影响 生物产业与信息产业是一个国家的两大经济支柱；转基因食品；转基因药物（如减肥药，增高药）

HGP对生物进化研究的影响 生物的进化史，都刻写在各基因组的“天书”上；人是由300～400万年前的一种猴子进化来的

HGP带来的负面作用 种族选择性灭绝性生物武器；基因专利战；基因资源的掠夺战；基因与个人隐私。