第二节 比色法和可见分光光度法 一. 概述 (1) 比色法和可见分光光度法的特点 比色法: 在分析化学中, 利用比较 有色溶液颜色的深浅来测定物质含 量的分析方法称为比色法。过去大 多用眼睛观察比较, 故又称目视比 色法。

光电比色法(分光光度法): 随着近代分析仪器的发展, 目前已 普遍使用光电比色计(分光光度计)通 过测量有色溶液对入色光的吸收程度 对物质进行分析, 称为光电比色法(分 光光度法)。

与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。

(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用波长来描述, 其单位常用纳米(nm)表示, 波长越短, 能量越高。

具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。

互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。

物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。

例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。

吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。

二、朗伯-比尔定律 (1) 朗伯-比尔定律 透光度(透光率T): 吸光度(A): 朗伯-比尔定律:

此式表明: 当一束平行的单色光通 过吸光物质的均匀溶液时, 溶液的吸 光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成 正比。 K:比例常数, 与入射光波长, 溶液 中吸光物质的本性及溶液的温度有 关。

(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a与ε的关系:

比吸光系数( ): 指质量浓度 为 1%(g/mL), b为1cm时的吸光度 值, 单位为mL/g · cm 同一物质的ε与 之间的关系:

例1 一含Fe2+浓度为0.5mg/L的溶 液, 用邻二氮菲显色测定, 吸收池厚 度为2cm,在508nm处测得吸光度为 0.19, 求其摩尔吸光系数和比吸光系 数。

(3) 偏离朗伯-比尔定律的原因 标准曲线: 根据朗伯-比尔定律,当 吸收池厚度不变, 以吸光度为纵坐 标, 浓度为横坐标作图时, 应得到一 条通过原点的直线, 称为校正曲线或 标准曲线。

偏离朗伯-比尔定律的主要原因: ① 定律仅适用于稀溶液 ② 化学变化引起的偏离(正偏离) ③ 非单色入射光引起的偏离(负 偏离)

三. 方法和仪器 (1) 目视比色法 目视比色法: 用眼睛观察比较溶液颜色深 度以测量物质含量的分析方法称 为目视比色法。

标准系列法的原理: 朗伯-比尔定律对标准系列法原 理的解释: A=εsbscs=εxbxcx

标准系列法的优点: ① 仪器简单, 操作简便,适宜于大批 试样分析 ② 适宜于稀溶液中微量组分的测定 ③ 某些不完全符合朗伯-比尔定律 的显色反应, 仍可用此法进行测 定。 标准系列法的缺点: 准确度较差。

(2) 光电比色法和可见分光光度法 ① 光电比色法的原理: 所用仪器为光电比色计。 光源→滤光片→一定波长范围的近似单色光→有色溶液→透过光→光电池→检流计的标盘

可见分光光度法所用的仪器称为 分光光度计, 它是利用分光能力很强的 棱镜或光栅的原理, 作为单色器, 可连 续获得不同波长的单色光, 其波长范围 比用滤光片获得的更窄。因此用分光 光度计可连续测量某一定浓度有色溶 液在不同波长下的吸光度, 从而可得其 吸收光谱,通过吸收光谱可选择最适宜 的测定波长。

所以分光光度计采用适当的光源 和检测器, 使测量的范围不只局限于 可见光区。如用红外光作为光源成 为红外分光光度法; 用紫外线作为光 源称为紫外分光光度法。

② 光电比色计和可见分光光度计的 基本部件 单色器 吸收池 光 源 检测器 指示器

a. 光源 要求: 光源须具有足够的辐射强度, 且稳定性好。 钨灯是可见分光光度计常用 的光源。

b. 单色器 光电比色计: 用滤光片获得单色光。 选择滤光片的原则是: 滤光片最易 透过的光应是有色物质最易吸收的 光, 即滤光片的颜色与溶液的颜色应 为互补色; 也可以使用不同的滤光片 测量同一有色溶液的吸光度, 测得吸 光度最大时所用的滤光片就是最适 宜的滤光片。

分光光度计: 单色器由棱镜或光栅、 狭缝和准直镜等部分组成。 种, 它们对不同波长光具有不同的折 射率。石英棱镜对紫外光分光效果好, 棱镜: 色散元件, 有石英或玻璃两 种, 它们对不同波长光具有不同的折 射率。石英棱镜对紫外光分光效果好, 玻璃棱镜对可见光分光效果好, 因为 玻璃对紫外光有吸收, 故不能用于紫 外光区。

涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。 光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。

c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。

d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。

优点: 光电池灵敏度较高, 产生的光电 池不需要经过放大便可直接用 灵敏检流计测量。 缺点: 光电池经强光照射或连续使用时 间过长, 易产生“疲劳现象”, 导致 灵敏度降低, 遇此情况, 应暂停使 用并避光放置, 待其复原后再用。

光电管: 国产721型分光光度计

e. 指示器

(3) 常用光电比色计和分光光度计 光电比色计: 国产581-G型, 仪器通 常配有红色、绿色、蓝色三块滤光 片, 其透过光的最大波长分别在650、 530和440mm左右。

可见光光度计: 国产721型分光光度计

四、显色反应及其影响因素 显色反应: 将被测组分转变为有色 化合物的反应称为显色反应。 显色剂:使被测组分显色的试剂称 为显色剂。

(1) 对显色反应的要求 ① 选择性好 ② 灵敏度高 ③ 有色化合物组成恒定 ④ 有色化合物的化学性质稳定 ⑤ 显色剂在测定波长处无明显吸收

(2) 显色剂 显色剂可分为无机显色剂和有机显 色剂两大类。由于大多数有机显色 剂能与金属离子形成稳定的有特征 颜色的螯合物, 灵敏度较高, 选择性 也较好。因此, 在比色分析和光度分 析中主要选用有机显色剂。

两种常用的有机显色剂： ① 邻二氮菲 其结构式为 这是目前广泛用于测定Fe2+的较好的显色剂。先用盐酸羟胺把待测试液中的Fe3+还原为Fe2+ ,然后在pH5~6的条件下,与邻二氮菲反应,生成稳定的橙红色配合物，配合物的λmax为508nm.反应是特效的,灵敏度也较高，摩尔吸光系数ε为1.1×104L/mol.cm。

②. 双硫腙 其结构式为

(3) 影响显色反应的因素： ① 显色剂的用量： 显色反应表示式: M+R MR (被测组分)(显色剂)(有色配合物) 显色剂的用量应当适宜,其用量是 通过实验确定。

实验方法为：固定被测组分的浓度和 其它条件,改变显色剂在溶液中的浓度 cR,分别测量吸光度(A),绘制A-cR曲线。

② 溶液的酸度 适宜酸度范围确定方法： 固定显色剂和被测组分的浓度, 改变溶液的pH值,分别测量吸光度, 绘制A- pH曲线。曲线平坦部分所 对应的pH值即为适宜的酸度范围。

③ 显色时间 作吸光度-时间曲线, 确定适宜的 显色时间。 ④ 显色温度 ⑤ 溶剂的性质 ⑥ 共存离子的干扰及其消除

消除共存离子干扰的方法： a.控制溶液的酸度 b. 加入掩蔽剂 c. 分离干扰离子

五、光度测量条件的选择 (1) 选择合适波长的入射光 ① 选被测有色物质的λmax为入射 光 ② 如在λmax处显色剂或干扰组分 有明显的吸收, 则应选灵敏度较 低但能避免干扰的适宜波长的光 作为入射光。

(2) 选择适宜的参比溶液 ①. 当被测溶液、显色剂及所用其他试剂均无色,可用纯溶剂作为参比溶液, 称为溶剂空白。 ②. 当显色剂无色而被测试液中存在其他有色离子时,可用不加显色剂的被测试液作为参比溶液,称为试样空白。 ③. 当显色剂或其他试剂有色,可用显色剂或其他试剂作为参比溶液,称为试剂空白。

④. 用不含被测组分的试样, 在相同条件 下与被测试样同时进行处理, 测吸光 度时以前者所得溶液为参比溶液, 称 为平行操作空白。如临床上进行某 种药物浓度的监测,取正常人血样和 待测血药浓度的血样在相同条件下 处理, 用前者得到的溶液作为参比溶 液。

(3) 控制适当的吸光度读数范围 适宜读数范围: 吸光度A在0.15~1.0内， 或透光度T值在0.10~0.70内。 六.比色法和可见分光光度法的定量方法 (1) 校正曲线法(适用于经常性的批量分 析） (2) 标准对比法（标准品对照法） 此法适宜于非经常性的分析工作。

当校正曲线通过零点时,将样品溶液和一标准溶液在选定实验条件下显色,测得吸光度分别为Ax和As,标准溶液的浓度为cs,则样品溶液的浓度cx可按下式求得：

在药物分析中, 为了测定方便, 通常 使被测试样称样量和稀释倍数与标准 试样一致,则被测试样的含量ω可由测 量的两者吸光度的比求得,即

另外,在药物分析中,还常用与标准 品的比吸光系数比较进行含量测定。 如被测试样称样量和稀释倍数与标准 品一致,在相同条件下,测得被测试样 与标准品的比吸光系数分别为 和 则试样质量浓度 为

七. 比色法和可见分光光度法在医学检 验中的应用 全血中铁的测定 全血中铁的测定需要先将各种形式的铁转化为游离的Fe3+离子。通常用消化法,蛋白质用钨酸沉淀除去,取无 蛋白的滤液,在一定条件下加KSCN显色剂,生成血红色配合物,反应式为

在520nm波长处或用蓝绿色滤光片 测量吸光度,与标准溶液比较,求出含 量。