第 十一 章 DNA 的 生 物 合 成

学习目的与要求： 1. DNA复制的机制 2. DNA复制的有关物质及其作用 3. DNA复制的过程 4. 真/原核生物DNA复制的特点 5.反转录作用及反转录酶的特点 6.DNA损伤的原因及修复机制 重点： 1. DNA复制的机制及过程 2.真/原核生物DNA复制的特点 3.反转录作用及反转录酶的特点 4.DNA损伤修复机制 难点： 1. DNA复制的有关物质及其作用 2. DNA复制的过程 3.DNA损伤修复机制

第一节 DNA的复制 一、DNA复制的机制 (一). DNA半保留复制 1. DNA半保留复制的概念 亲代 子代 新合成

2. 半保留复制的时期

3. 半保留复制的证明 N15 N14 N15-14 原 1 2 3

(二). DNA半不连续复制 3’ 5’ 解链方向 子代DNA中的一条链的合成是连续的，另一条链的合成是不连续的，DNA的这种复制方式称为半不连续复制。 1968年，冈崎的著名实验观察到DNA复制过程中，有一些不连续片段，称为冈崎片段。 原核生物中冈崎片段约含1000—2000个核苷酸，真核生物约为400个核苷酸. 新DNA的一条链是按5’ 3’方向（与复制叉移动的方向一致）连续合成，称为“前导链”；另一条链的合成是不连续的，即先按5’ 3’方向（与复制叉移动的方向相反）合成冈崎片段，再连接成一条完整的链，称为滞后链。

真核生物DNA复制叉结构示意图 前导链 滞后链 复制叉移动

冈崎片段与半不连续复制（okazaki 1968年）

1. DNA聚合酶的性质 模板：单链DNA 引物：RNA 底物：dNTP, 辅助因子：Mg2＋, 合成DNA的方向：5’ 3’方向延伸

DNAPolⅠ DNAPolⅡ DNAPolⅢ 2. 原核生物DNA聚合酶 功能及性质 种类 分子量 组成 分子数/Cell 聚合速度bp/min 5’-3’聚合作用 5’-3’外切活性 3’-5’外切活性 DNA合成中作用 109 一条肽链 400 667-1000 有 切引物 效正 修复 120 17-100 40 无 440 十条肽链 10-20 50，000 聚合

DNAPolⅢ的全酶由10种亚基组成(αβγδδ，εθτχψ)，α

3.真核生物DNA聚合酶 - 复制 修复 复制、引发 功能 － 5′→3′外切活性 ＋ 5′→3′聚合活性 核 线粒体 细胞内定位 256 170 160-300 36-38 ＞250 分子量（KD) 5 2 4 亚基数 ε δ γ β α - 3′→5′外切活性

3’ 5’ P (二).DNA连接酶 该酶可将DNA中单链缺口上相邻的两个核苷酸，以磷酸二酯键连接起来。 Ligase HO DNA连接酶有两种:一种以ATP为能量来源的动物细胞和 某些噬菌体连接酶--T4连接酶，另一种以NAD+为量来源 的大肠杆菌DNA连接酶。 作用方式如下： 5’ 3’ HO P ATP NAD AMP+PPi NAD+AMP Ligase

(三).解螺旋酶 解链酶（或称解螺旋酶）: 此酶通过水解ATP以获得能量去松开双股DNA，每解开一对核苷酸需水解2分子ATP。解链酶对单链DNA的亲和力强，而对双链DNA或RNA的亲和力弱，复制时DNA解链酶可以沿着滞后链模板的5’—3’方向随着复制叉的前进而移动，以解开双链。 (四).拓扑异构酶 拓朴异构酶Ⅰ(Topo Ⅰ )：原核生物中曾称为ω—蛋白。真核生物中曾用过多种名称，如转轴酶、松旋酶、松弛酶和切豁封闭酶等。其作用是使双链DNA中的一股切断，使链的末端沿着螺旋轴按双螺旋反方向旋转，超螺旋消除后再将切口封闭，使DNA变为松弛状态。即松弛或消除负超螺旋,催化反应不需ATP。 拓朴异构酶Ⅱ(Topo Ⅱ )：又称DNA旋转酶。广泛存在于各种生物中。 作用是在水解ATP的同时能迅速使DAN链断开又接上，而使松弛态的DNA 转变为超螺旋状态，引入负超螺旋,在没有ATP时，它又可使负超螺旋 DNA变为松弛态。

(六).引物酶与RNA引物（primase 与primer） (五).单链结合蛋白 单链DNA结合蛋白（SSB）: 它与单链DNA结合，从而防止两条链重新形成双螺旋，结合后还能保护单链DNA不被核酸酶水解。因此，SSB在复制中维持模板处于单链状态并能抵抗核酸酶水解保持单链的完整。 (六).引物酶与RNA引物（primase 与primer） RNA引物和引物酶: 任何一种DNA聚合酶都不能催化复制的起始。都需要一个引物。多数情况下是以RNA片段为引物，由引物酶催化合成。引物酶是一种不同于催化转录过程的RNA聚合酶。引物酶通常需要和几种蛋白质因子结合形成引发体才能发挥作用。例如大肠杆菌的dna蛋白能协助引物酶识别起始位点，并与起始部位结合。 RNA引物的长度是不同的，在动物细胞中引物长度约10个核苷酸，第一个核苷酸常用ATP。细菌的引物为50—100个核苷酸，但也有仅2—4个核苷酸的。

三、DNA的复制过程 Topo酶解螺旋 1.合成的起始阶段 解螺旋酶解双螺旋 高级结构的解除 SSB结合单链DNA RNA引物的合成 2.合成的延伸阶段 3.合成的终止阶段 辨识起始点 RNA引物的合成 高级结构的解除 Topo酶解螺旋 解螺旋酶解双螺旋 SSB结合单链DNA 复制叉的移动 DNAPol延模板滑动 催化3’、5’-P二酯键形成 RNA引物的切除 RNA引物的切除后填补 缺口连接

5’ 3’ P-P- PPi

DNA复制过程总图

四、真/原核细胞DNA的复制的特点 复制的起始点 单/双起始点 多起始点 复制的终止点 单终止点 多终止点 复制的方向 单向/双向 双向 复制的方式 θ方式/滚环/D环 复制泡（眼） 复制子 一个/二个 多个（100-200KD） 原核生物 真核生物

真核细胞DNA的多起始点，双向复制 （富含AT区）

第二节、反转录作用（RNA指导下的DNA合成） 一. 反转录酶 1970年，Temin和Baltimore在致癌RNA病毒中 发现了转录酶（Reverse Transcriptase） 1.反转录酶的概念 以RNA为模板，以dNTP为底物催化合成DNA作用的酶称为 转录酶。即：催化反转录反应的酶称为反转录酶或称为依赖 RNA的DNA聚合酶(RDDP)。

2.反转录酶的特点 (1)引物为tRNA (2)模板为单链RNA (3)底物为dNTP (4)核糖核酸酶H（RNase H）的活性： 专一切除RNA- DNA分子中的RNA,全部或部分去除RNA

二. 逆转录作用 1.反转录作用的概念 以RNA为模板，以dNTP为底物在反转录酶的作用下合成DNA的作用称为反转录作用。以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的DNA称为cDNA. 2.反转录作用的过程 （cDNA) (或逆转录酶）

第三节、 DNA的损伤与修复 一.DNA的损伤与突变 1. 突变（mutation） 2.损伤原因 携带突变基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。 2.损伤原因 物理（紫外（见下页）、高能射线、电离辐射） 化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物） 生物因素（碱基对置换、碱基的插入/ 缺失造成移码）

当DNA受到大剂量紫外线（波长260nm附近）照射时， CC（10%）,CT（40%）,TT（50%）。 例如：TT二聚体。

二. DNA损伤修复 (一). DNA损伤修复的方式 1.光复活 2.切除修复 3.重组修复 4.SOS修复

1.光复活（photoreactivation） 光复活酶 (二). DNA损伤修复的机制 1.光复活（photoreactivation） 光复活酶 可见光-最有效波400nm, 激活生物界广泛分布（高等 哺乳动物除外）的光复活酶， 该酶分解嘧啶二聚体。是一 种高度专一的修复形式，只 分解由于UV照射而形成的嘧 啶二聚体。 激活 复盖 解除

2. 切除修复（excision repair） (1).切开 (2).复制 (3).切除 (4).连接

3.重组修复（recombination repair） 重组修复又称复制后修复（postreplication repair） 受损伤的DNA在进行复制时， 跳过损伤部位，在子代DNA链与 损伤相对应部位出现缺口。通过 分子间重组，从完整的母链上将 相应的碱基顺序片段移至子链的 缺口处，然后再用合成的多核苷 酸来补上母链的空缺，此过程即 重复修复。并非完全校正。 复制 重组 补缺

4.SOS修复 指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态 时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是 能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率， 但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error- Prone Repair ）。