第七章 酶学分析技术.

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第七章 酶学分析技术

本章内容概要: 第一节 酶活性测定的基本知识 第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型 第三节 同工酶测定 第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 第一节 酶活性测定的基本知识 第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型 第三节 同工酶测定 第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 第五节 酶活性测定最适条件的选择

本章教学要求:   1.掌握酶活性的国际单位定义,酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式;酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算方法;酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用;以NAD(P)H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用.   2.熟悉酶促反应进程;酶促反应底物动力学;酶学分析在临床诊 断上的应用。   3.了解Km值、Vmax值的应用及Km和Vmax的测定;同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择。

第一节 酶活性测定的基本知识 酶活性的概念 酶活性单位 酶活性单位的计算 酶促反应进程 酶促反应底物动力学

一、酶活性的概念 v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt。 酶活性即酶促反应速度,指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。 v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt。 底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t,反应速度为v 注:在实际测定酶促反应速度时,以测定单位时间内产物的生成量为好。

二、酶活性单位 定义:指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。 惯用单位:酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 国际单位 :1IU指在规定条件(最适pH,最适底物浓度)下,每分钟转化1mol底物的酶量。单位为IU/L 。 Katal单位:1Katal指在规定条件下,每秒钟转化1mol底物的 酶量,1Katal=60×106IU。

三、酶活性单位的计算 步骤: 明确测定方法的酶单位定义,按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位, 运用公式进行计算。

计算公式: 分光光度法测定的公式: (A测定 – A对照)·V总·106 每单位规定的保温时间 产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000(ml) 酶单位/升 = —————————×——————————×———————— 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量(ml) 分光光度法测定的公式: (A测定 – A对照)·V总·106 每单位规定的保温时间 酶单位/升 = —————————×———————— ·L·V标 实际保温时间

四、酶促反应进程 酶促反应进程曲线

酶量的测定: 通过酶活性测定间接测得酶的含量,因此,要准确测定酶量,应使酶浓度(〔E〕)与酶促反应速度成正比,即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度,即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期,在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。 酶促反应初速度 酶活性 酶的含量

五、酶促反应底物动力学 中间产物学说: 酶促反应进行时,酶首先与底物结合为中间产物,然后再催 化底物反应生成产物。E + S  ES → E + P

Vmax〔S〕 v = ————— 〔S〕+ Km 米-曼氏方程: Vmax〔S〕 v = ————— 〔S〕+ Km 上式中v代表反应速度,Vmax代表最大反应速度,〔S〕代表底物浓度,Km称为米氏常数。

(一)米氏常数的定义 由米-曼氏方程可以导出: (Vmax-v)〔S〕 Km = ——————— v 当v = 1/2Vmax时,Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数,具有重 要的应用价值。

(二)Km值的应用 1.鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数,在反应条件一定时,只与 酶的种类和底物的性质有关,与酶的浓度无关。不同种 类的酶其Km值不同,对于一种未知的酶,可在规定的 条件下测定其Km值加以鉴定。

某些酶的Km值 酶 底物 Km(mmol/L) 乳酸脱氢酶 丙酮酸 0.017 己糖激酶 D-葡萄糖 0.05 D-果糖 1.5 乳酸脱氢酶 丙酮酸 0.017 己糖激酶 D-葡萄糖 0.05 D-果糖 1.5 -半乳糖苷酶 D-乳糖 4.0 碳酸酐酶 H2CO3 9.0 过氧化氢酶 H2O2 25 蔗糖酶 蔗糖 28 糜蛋白酶 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 108

2.反映酶与底物的亲合力 Km值越大,酶与底物亲合力越小, Km值越小,酶与底物亲合力越大。 3.选择酶的最适底物

4.计算不同底物浓度时酶促反应速度相当于最 大反应速度的比率 根据米-曼氏方程可以计算 5.设计适宜的底物浓度 酶促反应进程曲线表明,只有初速度才能真正代表酶 活性,一般要求初速度达到最大速度的90%~95%、底物 消耗率为1%~5%。这样既可以近似地表示酶活性,又不 致于使底物浓度过高而造成浪费。

定义 :Vmax指酶完全被底物分子饱和时的反应速度。 应用: Vmax可用来计算酶的转化率(TN),即单位时间内每分子 酶可使底物发生化学反应的分子数,单位为分子数/秒。当反 应速度达到最大反应速度时,如果已知酶量,则可计算出酶的 转化率: TN =底物转化量(mol/s)/酶量(mol)

(四)Km和Vmax的测定 1.Linweaver-Burk作图法,又称为双倒数作图法 1 Km +〔S〕 Km 1 1 —— = ————— = ——— · —— + ——— v Vmax〔S〕 Vmax 〔S〕 Vmax

2.Cornish-Bowden作图法 又称为直线线性作图法。

第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型 酶活性的测定方法 工具酶 酶偶联测定法 底物浓度测定

一、酶活性的测定方法 固定时间法 按照对酶促反应时间的选择不同 连续监测法

终点法:在反应进行到预定时间后要终止反应。 两点法:该方法反应时间的预定是从t1~t2 。 (一)固定时间法 定义:测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。 分类: 终点法:在反应进行到预定时间后要终止反应。 两点法:该方法反应时间的预定是从t1~t2 。

缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。 特点: 优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。 注意:固定时间法时间段的预定不宜太长,一般以30~60分钟为宜。

(二)连续监测法 定义:测定底物或产物随时间的变化量,又称为速率法。 原理: 该方法每隔一定时间(10s~60s)测定一次底物或产 物的变化量,连续测定多点,然后将测定结果对时间作图 ,绘制反应速度曲线。

在方法设计上,选择紫外吸收法或色原显色法 特点: 在方法设计上,选择紫外吸收法或色原显色法 优点: 能动态观测酶促反应进程,可以明显地找到反应的线性期,结果准确可靠,标本和试剂用量少,可在较短时间内完成测定。 缺点: 要求高,要求能够精确地控制温度、pH值和底物浓度等反应条件,要求仪器具有恒温装置及自动监测功能,半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。

二、工具酶 定义: 分类: 工具酶:将作为试剂用于测定待测酶活性或底物浓度的酶。 偶联:工具酶与待测酶、工具酶与工具酶之间的联合。 工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水解酶类

常用工具酶的名称及其缩写符号 名 称 缩写符号 名 称 缩写符号 己糖激酶 HK 乳酸脱氢酶 LDH 肌酸激酶 CK 苹果酸脱氢酶 MDH 名 称 缩写符号 名 称 缩写符号 己糖激酶 HK 肌酸激酶 CK 丙酮酸激酶 PK 甘油激酶 GK 脂蛋白脂肪酶 LPL 胆固醇酯酶 CE 脲酶 肌酐酶 乳酸脱氢酶 LDH 苹果酸脱氢酶 MDH 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 G6PD 谷氨酸脱氢酶 GLDH 葡萄糖氧化酶 GOD 胆固醇氧化酶 COD 磷酸甘油氧化酶 GPO 过氧化物酶 POD

三、酶偶联测定法 应用:对于底物或产物不能直接测定或难于准确测定的酶促反应 。 Ex Ea Ei A B C P Ea又称为辅助酶,Ei又称为指示酶,C P称为指示反应。

(一)酶偶联反应的原理 在应用酶偶联法测定时,关键在于确定恒态期,因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述,恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定。

(二)常用指示酶及其指示反应 1.脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶,例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等,它们催化下列反应: P + NAD(P)H + H+  PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定 应用:ALT、AST、CK等酶活性测定。

2.过氧化物酶 POD可催化过氧化氢与某些色原反应,例如与4-氨基安替比林(4-AAP)和酚反应,将其氧化为有色物质,反应如下: Trinder反应: POD 2H2O2 + 4-AAP + 酚 醌亚胺(红色) + 4H2O 应用:GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶(属于氧化酶类)等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢,因此都可以与POD偶联,通过Trinder反应加以测定。

四、底物浓度测定 利用酶催化反应的高效率和专一性,可以测 定底物浓度。与酶活性测定类似。

第三节 同工酶测定 同工酶的定义 同工酶产生的机理 同工酶的测定方法

同工酶的定义 是催化功能相同,但是分子组成及理化性质不同 的一组酶,是在同一种属中由不同基因位点或等位 基因编码的多肽链单体、纯聚体或杂多体。

一、同工酶产生的机理 (一)由不同基因位点编码 (二)由等位基因编码 (三)由多肽链化学修饰产生

二、同工酶的测定方法 (一)按照理化性质不同进行分离鉴定 1.电泳法 同工酶氨基酸组成不同,等电点不同,电泳迁移率 也就不同,据此可用电泳法分离鉴定。 2.层析法 根据同工酶分子荷电量不同,可用离子交换层析法 加以分离。

(二)按照底物专一性不同进行鉴定 (三)按照最适pH不同进行鉴定 同工酶底物专一性不同,Km值也不同。如果同工酶之间的Km值差别足够大,可以通过测定其Km值加以鉴定。 (三)按照最适pH不同进行鉴定 同工酶分子氨基酸组成不同,最适pH也不同。如果同工酶最适pH之间的差别足够大,可以通过调节缓冲溶液的pH值加以鉴定。

(四)按照免疫学特性不同进行分离鉴定 (五)按照耐热程度不同进行鉴定 (六)选择性抑制法

第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 血浆酶的来源 酶的区域化分布 酶活性测定在临床诊断中的应用 同工酶的诊断价值

一、血浆酶的来源 血浆特异酶 血浆酶 外分泌酶 非血浆特异酶 细胞内酶

二、酶的区域化分布 诊断常用血清酶的来源 血清酶 符号 来源 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝 血清酶 符号 来源 鸟氨酸氨基甲酰转移酶 OCT 肝 卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT 肝 谷氨酸脱氢酶 GLDH 肝 山梨醇脱氢酶 SDH 肝 丙氨酸氨基转移酶 ALT 肝、肾、心 异柠檬酸脱氢酶 ICD 肝、胎盘、心 -谷氨酰转肽酶 -GT 肝、胆、肾、小肠 5ˊ-核苷酸酶 5ˊ-NT 肝、胆道 单胺氧化酶 MAO 肝、肾、脑 天门冬氨酸氨基转移酶 AST 心、肝、骨骼肌 肌酸激酶 CK 骨骼肌、心、脑 乳酸脱氢酶 LDH 心、肾、骨骼肌、肝、肺 碱性磷酸酶 ALP 小肠、胎盘、肝、肾 酸性磷酸酶 ACP 前列腺、红细胞、血小板 淀粉酶 AMS 胰、唾液腺 脂肪酶 LPS 胰

三、酶活性测定在临床诊断中的应用 四、同工酶的诊断价值 (一)在肝脏疾病诊断中的应用 (二)在急性心肌梗死诊断中的应用 (三)在急性胰腺炎诊断中的应用 (四)在骨骼疾病诊断中的应用 (五)在肌肉疾病诊断中的应用 (六)在前列腺疾病诊断中的应用 (七)在肿瘤诊断中的应用 四、同工酶的诊断价值

第五节 酶活性测定最适条件的选择 (一)标本 (二)测定条件 底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助因子、激活剂和抑制剂