Recombinant DNA Technology Dr. Hui LI Office : S408 Tel: 26538722

Expression of recombinant gene Topic 5 Expression of recombinant gene (Prokaryotes)

1. Gene expression 遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程——中心法则（central dogma）。

2. Expression of recombinant gene

3. Expression of recombinant gene in prokaryote Prokaryotic promoter SD sequence MCS terminator A dividing E. coli

3. 1 Remarks on prokaryotic expression system 1. 只有一种RNA多聚酶 识别原核细胞的启动子，催化所有的RNA合成。 2. 以操纵子(operon)为单位 数个相关的结构基因与其调控区结合形成一个表达的协同单位。

3. 转录和翻译偶联、连续进行。 5’ 3’ 有意义链 3’ 反意义链 5’ 转录 5’ mRNA 3’ 翻译 N 蛋白质 C

Shine-Dalgarno（S-D）sequence: 4. 不含内含子(intron)，缺乏转录后的加工系统。 5. 调控主要在转录水平上。 6. mRNA的核糖体结合位点。 Shine-Dalgarno（S-D）sequence: 含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。

3.2 Attention when we express recombinant gene in prokaryotes 1. 外源基因不能带有内含子。 2. 必须用cDNA 3. 不能直接用真核基因组DNA。 4. 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 5. 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害。

3.3 Principal factors in bacterial expression

3.3 Regulation of prokaryotic gene expression 1. 启动子 (promoter) 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 （1） 启动子序列 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。 -35 Box and -10 Box

E. coli Promoter Sites

consensus sequences

① -35box RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5’-TTGACA-3’ ② -10box（Pribnow Box): The Pribnow box has a function similar to the TATA box that occurs in promoters in eukaryotes and archaea: it is recognized and bound by a subunit of RNA polymerase during initiation of transcription 5’-TATAAT-3’ 5’ TTGACA TATAAT 转录起始位点 17bp 核糖体结合位点

结合区

（2）翻译的起始位点 ①核糖体结合位点（ RBS） ribosome binding site i）Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 SD mRNA 5’—AGGAGGU——AUG—— UCCUCCA 16S rRNA3’ S-D序列距离AUG的距离也影响翻译

ii）起始密码： 位于SD序列下游。 AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）

2. RNA polymerase （1）结构 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。 全酶是一个5聚体，含有两个α小亚基，和2两个大亚基（β和β′），一个σ亚基。

3. 转录终止子 启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。 内终止子 intrinsic terminator： E.coli中促使转录终止的DNA位置有一段反向回文顺序，其后紧接一串A，称为内终止子，形成终止信号。

原因： ① 茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作用 ② 多聚A/U 由于茎环3’段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。

mRNA折叠 RNA聚合酶 5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA) C U C U G 5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板) 转录↓ 5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU-OH-3(RNA) RNA折叠↓ C U C U G 脱落 G—C mRNA折叠 A—U C—G C—G G—C C—G RNA聚合酶 C—G G—C A A CCCAC UUUU—3 DNA

4. 翻译终止密码 （Stop codon） 5. 翻译增强子（Enhancer） 大肠杆菌偏爱UAAU。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。 5. 翻译增强子（Enhancer） 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。

6. 基因工程常用的原核启动子 （1）最佳启动子必须具备的条件 ① 必须是一种强启动子 6. 基因工程常用的原核启动子 （1）最佳启动子必须具备的条件 ① 必须是一种强启动子 能使外源基因的蛋白产量达到细胞总蛋白的10%-30%以上。 ② 应呈现低水平的基础转录 便于表达毒性蛋白等。 ③应是可诱导型的 用温度或化学试剂诱导。

Inducible bacterial promoters Why not to use constitutive, always strong promoter? Bacterial grow takes time…. Because recombinant (alien) protein is often toxic for bacterial cell. Bacteria tend to expel harmful plasmids Induction

（2） 乳糖启动子lac 来自大肠杆菌的乳糖操纵子。 用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白结合，解除抑制。 Plac O 目的基因

阻遏物与操纵基因结合

四聚体的阻遏物

阻遏物与DNA的结合

①乳糖操纵子控制区的结构 “可移动的lac启动子小片断” 组成： 阻遏物作用区 CAP作用区 RNA聚合酶作用区 长度： 203bp的HaeIII片断 （包括β-半乳糖苷酶的前8个密码）。

IPTG =异丙基硫代-β-D半乳糖 IPTG有毒、昂贵，不理想。

BL(DE3) inducible system and pET vectors (invented in 1984 by Bill Studier, on sale by Novagen) Gene of interest is expressed from strong T7 promoter pET23 1) T7 RNA polymerase gene is integrated in chromosome under the control of a lac promoter and operator 2) lactose analogue, IPTG, causes the host to produce T7 RNA polymerase 3) The E. coli host genome also carries the lacI (repressor) gene

Why repressor gene and gene of interest are expressed from different DNA molecules? Repressor gene expressed from chromosome; Gene of Interest expressed from plasmid If too high repressor  no transcription (you need to increase expensive IPTG) If too low repressor  promoter is leaky (active without IPTG) Repressor is in chromosome, because there it is best kept controlled there (no plasmid loss, not too high expression)

（3）色氨酸启动子trp trpR trpR 启动子； 衰减子 阻遏蛋白基因； 操纵基因； 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子。 P1 O  trpE trpD P2 trpC trpB trpA P1 trpR 阻遏蛋白基因； 启动子； P2 衰减子 操纵基因；  O

色氨酸操纵子

trpR 转录 邻氨基苯甲 色氨酸 吲哚甘油 酸合成酶 合成酶 硼酸合成酶 链 链 阻遏物 邻氨基 苯甲酸 磷酸核糖基 邻氨基苯甲酸 （P1是主要启动子，P2的作用只有3%。） 没有色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，能转录合成色氨酸所需要的酶。 trpR P1 O  trpE trpD P2 trpC trpB trpA 转录 链 链 阻遏物 邻氨基苯甲 酸合成酶 色氨酸 合成酶 吲哚甘油 硼酸合成酶 邻氨基 苯甲酸 磷酸核糖基 邻氨基苯甲酸 分支酸 吲哚甘 油-磷酸 CDRP 色氨酸

有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸结合后才能与操纵基因结合，从而阻止色氨酸合成酶类的转录（称为corepressor）。 trpR P1 O  trpE trpD P2 trpC trpB trpA 结合 不转录 阻遏物 色氨酸 用于表达载体的trp启动子一般只包含启动基因、操纵基因、和部分trpE基因。 P1 O trpE 目的基因

（4）PL和PR启动子 是从噬菌体中得到的一类启动子，比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高。 cIII N PL/OL PM OR/PR Cro PE cII N:抗终止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）； cI, cII, cIII: 阻遏蛋白； P:启动子；O:操纵子。 R:右；L:左

早期左边 早期右边 阻遏物 转录 转录 cIII N PL/OL cI PM OR/PR Cro PE cII 转录 当cI合成后，与OL和OR结合阻止RNA聚合酶，则左右基因都受到抑制。但促进PM使cI进一步转录。进入溶原期。

cI857: 表达载体常用的噬菌体启动子是PL。 调节基因cI 则是选择了一个温度敏感性的突变基因cI857。 整合在宿主基因组里，或克隆到载体上。 cI857 PL 外源基因 cI857: 28oC时阻遏PL，外源基因不转录。 42oC时阻遏蛋白失活，外源基因大量转录

3.4 Where your expressed protein will be located? Secreted (!!) E.Coli can not do that Inclusion bodies (insoluble) Cytoplasm (soluble) Periplasmatic space (soluble or insoluble)

Inclusion bodies (most common case) -- Inclusion bodies are formed through the accumulation of folding intermediates rather than from the native or unfolded proteins. -- It is not possible to predict which proteins will be produced as inclusion bodies. -- Production of inclusion bodies not dependent on the origin of protein, the used promoters, the hydrophobicity of target proteins...

Protein Folding Page 116 Electron micrograph of an inclusion body of the protein prochymosin in an E. coli cell

Good side of inclusion bodies inclusion bodies can be accumulated in the cytoplasm to much higher level (greater than 25%) than production as soluble form; 2) inclusion bodies is initially isolated in a highly purified, solid, and concentrated state by simple physical operation (centrifugation). 3) inclusion bodies have no biological activity. For toxic proteins it may be the only one available; 4) inclusion bodies are resistant to proteolysis That results in the high yield of protein production.

① 优点 使重组蛋白易于分离、免受蛋白酶降解、不损害寄主细胞 ② 缺点 回收的蛋白生物活性差。

2. 周质中表达 （1）周质（periplasm） 革兰氏阴性大肠杆菌位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 蛋白质从细胞质转运到周质的复杂机理目前不完全清楚 优点： 容易被浓缩和纯化、有利于正确折叠、被降解的少。

（3）常用的原核信号肽 （2）信号肽（signal peptide） 能带领蛋白穿过膜到达周质。但以后需要正确切割掉。 一般位于N端。 ①大肠杆菌的信号肽： phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、β-内酰胺酶（lactamase）、 肠毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等

（2）真核信号肽 ②金黄色葡萄球菌的蛋白A。 ③枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶 （endoglucanase）。 ④胡萝卜欧氏杆菌的PelB蛋白。 （2）真核信号肽 也能在细菌中起作用。 鼠源RNase、人生长激素信号肽。

3. 胞外表达 使在大肠杆菌细胞中表达的外源蛋白分泌到细胞外的培养基中。 用溶血素（hemolysin）基因构建分泌性融合蛋白； 或与细菌素释放蛋白（bacteriocin release protein)共表达。 由于需要穿过两层膜，大肠杆菌只能分泌极少的蛋白质到培养基中，效果都不太理想。

3.5 Several examples on expression vector 1. 非融合型表达载体 载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。 S-D序列 ATG-外源基因-TAG 优点 产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点： 容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。

（1）pKK223-3 载体 哈佛大学的Gilbert实验室建立的。表达能力强。 组成结构： ① 强启动子: tac（trp-lac）: lacUV5的-10区 ②操纵基因： 乳糖操纵子系统。 lac操纵基因

Lac I ③调节基因： 宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。 ④终止子： rrnB的强终止子 rrnB强终止子 ⑤S-D序列和插入位点区： S-D 插入位点区

⑥载体的其余部分： 来自pBR322质粒。 ⑦表达诱导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解） 宿主lac I 阻遏物 IPTG tac P Lac O S-D 插入位点区 rrnB T

条件： 必须选择一个有lacI的宿主菌。

2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 如：pIN III系列： pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, （1）组成结构

① 强启动子： Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 ②调节基因：lac I ③S-D序列和起始密码ATG。 ④分泌信号肽： 大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 ⑤插入位点区（多克隆位点）。 Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点

pIN III-comA1 以pBR322为基础构建的。 调节基因不必借助于宿主的lacI.

3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 （1）优点 便于融合蛋白的分离和纯化。 （2）组成结构 ①启动子：tac ②操纵基因：lacP ③调节基因：lacI ④S-D序列 22

（3）产物提纯 ⑤ori：pBR322 ori ⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶） lacI tac lacP lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA （3）产物提纯 GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。

（4）产物分离 用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。 柱（column） 外源蛋白 GST 凝血酶 柱（column） GST 洗脱 柱（column） GST 可再利用

pGEX Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp BamH I EcoR I pGEX-1T 插入区： 凝血酶 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGA BamH I EcoR I

Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp pGEX-2X的插入区： 凝血酶 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACG EcoR I BamH I Sma I pGEX-3X的插入区： Xa因子 Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGAC EcoR I BamH I Sma I

（5）其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）： 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。

人胰岛素在大肠杆菌中的表达 Cyanogen bromide： 溴化氰

3.6 Factors influencing the efficiency of expression 1. 启动子的结构对表达效率的影响 （1）一致顺序 ① -35box 5’-TTGACA-3’ RNA聚合酶 σ亚基的识别位点 ② -10box（Pribnow Box） 5’-TATAAT-3’

（2）-35区与-10区之间的距离 （3） -35区和-10区的碱基顺序 一致顺序 5’-TTGACA TATAAT 5’-TTTACA 间隔为17bp时，启动子最强。 （3） -35区和-10区的碱基顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 -35box -10box 一致顺序 5’-TTGACA TATAAT lac 5’-TTTACA TATGTT trp 5’-TTGACA TTAACT PL 5’-TTGACA GATACT recA 5’-TTGATA TATAAT tac I 5’-TTGACA TATAAT tac II 5’-TTGACA TTTAAT

2. 转译起始序列对表达效率的影响 （1）S-D序列 5’-AGGAGGU-3’ ？？？？ S-D序列后面的4个碱基： 如果是A（T）, 翻译效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25%。

（2）起始密码AUG AUG左侧的三个碱基也有影响。 -半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。

（3） 其它 多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。 噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U。

3. 启动子与外源基因之间的距离

6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响 4. 转录终止区对表达效率的影响 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。 5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。 6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响

3.7 How to improve the expression level? 选择强启动子序列，如tac 等 2. 调整S-D序列与AUG碱的距离 一般为5-9bp。 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离。 3. 改变起始密码下面的几组密码子 能提高翻译的起始效率。

4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系。 （1）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开。 一般采用温度诱导或药物诱导。

（2）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。 当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。 当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。

（1）设计成融合蛋白 6. 提高表达产物的稳定性 防止被宿主的酶降解。 这是避免被降解的最好措施。 N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。 N 质粒基因产物 目的基因产物 C 切割

（2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。 ①使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 ②大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 ③T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。

（3）表达分泌蛋白 外膜 内膜 细胞质 周间质 染色体 质粒 “外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。

细菌蛋白分泌的条件： 碱性氨基酸 疏水氨基酸核心区 切割位点 外源蛋白 Arg、Lys Leu、Ile AlaGlySer 信号肽酶 ① 有信号肽。 位于N端，一般为15-30aa 。真核与原核的结构相似, 功能相似，可以互换。 N 碱性氨基酸 疏水氨基酸核心区 切割位点 外源蛋白 Arg、Lys Leu、Ile AlaGlySer 信号肽酶

② 蛋白质内有与分泌相关的aa 序列。 为蛋白指明目的地。 ③ 细胞内的转运机制。 信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。 真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达； 但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。

3.8 Problems with prokaryotic expression system 缺乏蛋白质的加工。 （如糖基化、氨基酸修饰等）。

1. 形成正确的二硫键 (Disulfide bond ) 分子内二硫键、分子间二硫键。二硫键异构酶催化。使蛋白质能够正确折叠。

人胰岛素分子

人血红蛋白分子 抗体分子

2. 前体切割 如信号肽、内含肽（intein）等序列的切割。

3. 蛋白质糖基化 (Glycosylation) 增加蛋白质的稳定性和某些特殊性质。 （1）O-糖基化（Ser, Thr） 糖基

（2）N-糖基化（Asn） Dol：长醇 Mannose：甘露糖 Glucose：葡萄糖 N-AcGlc：N乙酰氨基葡萄糖

4. 氨基酸残基的修饰 磷酸化、乙酰化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、软脂化 羟脯氨酸 甲基组氨酸 羟赖氨酸 羧基谷氨酸

3.9 Other bacteria Bacillus Antibiotic Producers: B. brevis (e.g. gramicidin, tyrothricin), B. cereus (e.g. cerexin, zwittermicin), B. circulans (e.g. circulin), B. laterosporus (e.g. laterosporin), B. licheniformis (e.g. bacitracin), B. polymyxa (e.g. polymyxin, colistin), B. pumilus (e.g. pumulin) B. subtilis (e.g. polymyxin, difficidin, subtilin, mycobacillin). Pathogens of Insects: B. larvae, B. lentimorbis, and B. popilliae are invasive pathogens. B. thuringiensis forms a parasporal crystal that is toxic to beetles. Pathogens of Animals: B. anthracis, and B. cereus.  B. alvei, B. megaterium, B. coagulans, B. laterosporus, B. subtilis, B. sphaericus, B. circulans, B. brevis, B. licheniformis, B. macerans, B. pumilus, and B. thuringiensis have been isolated from human infections. The Genus Bacillus includes two bacteria of significant medical importance, B. anthracis, the causative agent of anthrax, and B. cereus, which causes food poisoning. Nonanthrax Bacillus species can also cause a wide variety of other infections, and they are being recognized with increasing frequency as pathogens in humans.

Bacillus Endospores Bacillus thuringiensis phase micrograph Bacillus anthracis Crystal violet stain viewed by light microscopy Spore stain of a Bacillus species. CDC. Mature spores stain green, whether free or still in the vegetative sporangium; vegetative cells and sporangia stain red.

Bacillus Bacillus strains used as production organisms: - B. subtilis - B. brevis - B. licheniformis Transformation systems: - via competent cells (during transition from vegetative cells -> sporulation, cell can take up DNA (ss) when population reaches a metabolic state called competence) - protoplast - plasmid rescue - bacteriophage-mediated transduction Vectors: - replicating plasmids (pUB110, pE194, pC194, pHP13, shuttle vectors) -> replicating plasmids with temperature-sensitive origin of replication (replication stops above certain temp. -> pE194 stops above 45ºC) - integrative vectors (normally shuttle vectors)

Transformation Systems

Integrative Plasmid No replicon for Bacillus -> selection in Bacillus driggers integration -> useful if construct should carry one copy of foreign gene -> integration of circular plasmid -> shuttle vectors

Integrative Plasmid No replicon for Bacillus -> selection in Bacillus driggers integration -> useful if construct should carry one copy of foreign gene -> integration of linear plasmid -> generate deletions -> shuttle vectors

Bacillus Promoters: - aprE promoter -> induction with onset of sporulation - amylase promoter -> growth-phase and nutrition regulated promoter (induction at end of exponential growth + repression by glucose) - sacB promoter (levansurase) -> not regulated - spac promoter -> hybrid promoter (subtilis phage + lac operator) -> induction with IPTG - T7 system -> hybrid system -> E. coli T7 system (IPTG induction) + T7 polymerase (on chromosome) under control of a xylose- inducible promoter - xylose-inducible promoter -> induction with xylose, strong promoter (200 times), repressed by glucose -> Bacillus is good secreter -> Signal sequence longer and N-terminus more pos. charged -> low GC-content bacteria

Bacillus as expression host

Bacillus as expression host

Other Bacteria for Gene expression: Gram positive: Staphylococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Streptomyces,... Gram negative: Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas,...

Products produced in Prokaryotic Systems Restriction Endonucleases -> produced in E. coli L- Ascorbic Acid (Vitamin C) -> recombinant Erwinia herbicola (gram-negative bacterium) Synthesis of Indigo (blue pigment -> dye cotton /jeans) -> produced in E. coli Amino Acids -> produced in Corynebacterium glutamicum (gram-positive bacterium) Lipases (laundry industry) -> from Pseudomonas alcaligenes produced in Pseudomonas alcaligenes Antibiotica (most of them from Streptomyces, other gram-positive bacteria, fungi) -> produced in recombinant Streptomyces and fungi (Penicillium) Biopolymers (PHB -> biodegradable plastics) -> produced in E. coli (stabilized with parB)