第二章基因工程的载体和酶 1 基因工程载体 常用基因工程载体有： 细菌质粒(克隆)； λ噬菌体(克隆)； 柯斯质粒(克隆)； 穿梭质粒(克隆/表达)； 细菌人工染色体(克隆/表达)； 酵母人工染色体(克隆/表达)； Ti质粒及其衍生载体(转化)。 用于承载、克隆、转移目的基因(DNA片段)，能自我复制的DNA分子。 高效运送外源基因转入受体细胞, 为外源基因提供复制能力或整合能力以及为表达提供必要的条件。 ☆基因工程中为什么要用载体？ ☆载体越来越小，装载量越来越大
载体的要求: 作为载体，应该具有以下一些性能：A、复制：具有能在受体细胞中复制的复制起点，基因工程的目的是要得到基因的无性繁殖系，并且要求得到最大量的某一基因或基因产物，因此一般要求用属于松弛型的质粒作为载体。细菌质粒ColE1是一种常用的载体；B、选择性标记：一般情况下，所要扩增的基因不便于选择，所以作为载体要求具有选择标记。ColE1对于大肠肝菌素E1的免疫性却不是一个理想的标记。R质粒具有最适宜于作为选择性标记的多种抗性基因，但不很安全；
C、限制性酶切位点：对于某一种限制性酶，它的切点数要求是单一的。现在已发展了许多具有多种单一的限制性酶识别位点的载体；D、载体的大小：原则上要求载体越小越好；E、外源基因的性状表达：结构基因的表达需要启动子；F、载体的安全性：要求质粒不能随便转移。 ☆什么能够作为载体？怎么做？
1.1质粒载体 1.1.1 What is a plasmid? A circular piece of autonomously replicating DNA ori bla Originally evolved by bacteria May express antibiotic resistance gene or be modified to express proteins of interest
The many faces of plasmids pGLO ori bla GFP araC Transmission electron micrograph Agarose Gel Graphic
1.1.2质粒的改造 野生的质粒往往不符合作为载体的要求，因此必须对它们进行改造： A、删除不必要的DNA区域。尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。 B、减少限制性酶切点。缺失突变，限制性酶、核酸外切酶核连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。
C、加入易于识别的选择性标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。 D、关于质粒安全性能的改造。灭活质粒在细菌之间转移的mob基因。 两个例子pBR322和pUC18/19
常用的抗生素抗性标记基因 注：1、新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因类似卡那霉素(Kanr)。 2、Ampr or Apr, Cmlr or Cmr, Tetr or Tcr.
☆为什么要用2个抗性标记？
抗药性标记选择(插入失活法)
常用的生化遗传标记基因： 1.β-半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 β-半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观； b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化而不影响酶活性； c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大。 2.葡萄糖苷酸酶基因（GUS） 该基因编码一种可分解各种β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。该标记基因除具有上述lacZ基因的优点外，它的适用范围十分广泛，因为许多生物中没有这种基因。 3.荧光素酶基因 荧光素酶或由萤火虫产生的可催化蜜蜂荧光素氧化的酶，并产生荧光，若在反应中加入CoA，可使灵敏度提高10倍；或由发光细菌（Photobacterium fischeri）产生的荧光素酶，它与FMN-氧化还原酶联用，通过NAD(P)H的变化测定酶活。 4.发光蛋白质基因(GFP) 发光蛋白是由水母产生的一种可发光的蛋白质，该蛋白质可使大肠杆菌菌落发绿色荧光。
pGLO Plasmid Beta Lactamase Green Fluorescent Protein Ampicillin resistance Green Fluorescent Protein Aequorea victoria jellyfish gene araC regulator protein Regulates GFP transcription pGLO ori bla GFP araC
☆ A multiple cloning site (MCS), also called a polylinker, is a short segment of DNA which contains many (up to ~20) restriction sites - a standard feature of engineered plasmids.Restriction sites within an MCS are typically unique, occurring only once within a given plasmid. 为什么需要？ ☆lacZ’-β半乳糖苷酶α-肽链（氨基端）
i P O lacZ - 调控蛋白P 产物呈现蓝色 β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15 a-互补显色反应（蓝白斑筛选） 分解X-gal β-半乳糖苷酶- α-肽段 调控蛋白P 诱导剂IPTG 分解半乳糖 分解X-gal 产物呈现蓝色
X-gal + C-terminus of b-galactosiase -peptide
α-互补(α-complementation)
经Taq DNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带 有单个A。正是基于这一原理，pGEM质粒经 EcoR V切成平端后，在开口端加上一个T制成 T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由 于T-A互补，从而提高了T载体与PCR产物之间 的连接效率。由于T-A克隆只需纯化PCR产物 ，因而操作较为简便。 pGEM-T vector含丝 状噬菌体f1的复制起始区，用于产生环状 ssDNA；含有T7和SP6 RNA聚合酶启动子；在 多克隆区域具有编码β-半乳糖苷酶的基因 (LacZ)，插入失活α-肽可在指示平板上通过 蓝、白菌落直接筛选重组菌落。 pGEM-T Vector图谱 特点: 1.克隆PCR产物 2.通过多克隆区域两侧的T7和SP6 RNA聚合 酶启动子进行体外转录 3.产生ssDNA 4.通过蓝、白菌落筛选重组体 5.多克隆区域提供选择克隆的酶切位点
1.1.3质粒载体的分类及用途 人工构建的载体根据其功能和用途可分为下列6类： A、克隆载体。用于克隆和扩增外源基因，它们或者含有能为氯霉素扩增的松弛型复制子结构，如pBR系列；或者复制子经过人工诱变，解除对质粒拷贝数的负调控作用，使质粒在每个细胞中可达数千个复制拷贝。
质粒pBR322为载体的克隆过程 ☆PCR扩增一个500bp的DNA片段并使用puc18/19作为载体进行克隆，描述棋原理过程和可能出现的问题及解决方法？
B、测序载体。这类载体通常高拷贝复制，并含有Polylinker,便于各种DNA片段的克隆与扩增。在Polylinker的两端含有两个不同的引物序列（T3/T5），使得重组质粒经碱变性后即可进行DNA测序反应，如pUC18/pUC19系列。另一种测序质粒是M13噬菌体DNA与质粒DNA的杂合分子，如M13mp系列，它们在受体细胞中复制后，可以特定的单链DNA形式分泌到细胞外，克隆在这种质粒上的外源基因无需变性即可直接用于测序反应。
C、穿梭载体。这种质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构以及相应的选择性标记基因，因此能在两种不同种属的受体细胞种复制并检测，如大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒、大肠杆菌-酵母菌穿梭质粒等。 ☆为什么要发展穿梭载体？
D、探针载体。这类载体被用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子等。它通常装有一个可以定量检测其表达程度的报告基因（如抗生素的抗性基因），但缺少相应的启动子或终止子，因此载体分子本身不能表达报告基因，只有当含有启动子或终止子的外源DNA片段插入到载体合适的位点上，报告基因才能表达，而且其表达量的大小直接反映了被克隆的基因表达调控元件的强弱。 ☆如何克隆终止子？
E、表达载体。这类载体在Polylinker的上游和下游分别装有转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点（SD-序列）以及强有力的终止子结构，使得克隆的外源基因均能在受体细胞中高效表达，如pSPORT系列和pSP系列。
1.1.4质粒的制备 目前一般使用碱变性法制备质粒，苯酚/氯仿纯化。分离得到的质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现多条带。这是由于不同的DNA构型所引起的。从大到小分别为OC-DNA, L-DNA, CCC(SC)-DNA. SC OC L
葡萄糖和EDTA 细菌培养过夜 离心收集菌体 加SolutionI SDS和NaOH,PH12.6 加SolutionII NaAc,PH4.8 加SolutionIII 溶解在TE中 沉淀干燥 抽提纯化
图2-2质粒的电泳图(A-E为不同质粒电 泳图，Marker为λDNA的HindIII酶切图)
1.2噬菌体载体 1.2.1λ噬菌体载体类型 什么是噬菌体?----噬菌体是一类细菌病毒的总称,Bacteriophage.见图. 以质粒为基础和噬菌体为基础构建的载体之间的比较.
噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。有的噬菌体基因组较大，如λ噬菌体和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。其中用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 噬菌体或病毒的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 1.高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞； 2.自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。
λ噬菌体是研究最清楚的大肠杆菌的一种双链DNA温和噬菌体, 也是最早使用的克隆载体之一. λDNA在噬菌体中是线状DNA分子，全长 48 λ噬菌体是研究最清楚的大肠杆菌的一种双链DNA温和噬菌体, 也是最早使用的克隆载体之一. λDNA在噬菌体中是线状DNA分子，全长 48.502kb，60个多基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ噬菌体可作为基因载体的依据.其两端,各有一个长为12bp的互补单链(5'-GGGCGGCGACCT-3'),称为粘性末端.当λ噬菌体进入寄主细胞内后, 其粘性末端能通过碱基互补作用, 形成环状DNA分子. 粘性末端形成的双链区域称为cos位点（cohesive end site), 它是包装蛋白的识别位点, λ噬菌体的包装与DNA特性和其它序列无关, 同时对包装的DNA大小有要求, 包装范围大约在35kb-51kb. 通过改造λ噬菌体, 人们发展了许多不同用途的噬菌体载体.
λ噬菌体的基因结构和功能
λ噬菌体的生活周期
λ噬菌体的改造和构建 基因组太大（49kb），酶切点太多，如有5个BamH1位点（G↓GATCC，只能接纳一定长度的DNA，即相当于λ噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb×5%=2.45kb的DNA， 重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞. (1)缩短长度；(2)删除重复的酶切位点增加一些单一的酶切位点； (3)加装选择标记；(4)构建琥珀密码子的突变体，琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。
以λ噬菌体为基础而构建的常用载体可分两类： 插入型表达载体和取代型载体 。 插入型载体 替换型载体
λ 在Charon 载体中克隆外源DNA
λ-DASHII载体的物理图 利用免疫功能正选择取代型载体
λ-DNA作为载体的优点 1.λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌。 2.λ-DNA载体的装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量。 3.重组λ-DNA分子的筛选较为方便。
1.2.2 M13噬菌体载体 M13噬菌体颗粒的外形呈丝状，其基因组DNA长约6.4kb,成熟的噬菌体为闭合环状单链正链DNA. M13单链DNA的复制型是呈双链环形，此时的DNA可同质粒DNA一样进行提取和体外操作。不论是双链的或是单链的M13DNA，均能感染寄主细胞，产生噬菌斑或形成侵染的菌落.
M13噬菌体产生单双链DNA的机制
作为克隆载体的优越性在于能象质粒那样转化进入受体细胞，也可以使用类似于质粒分离纯化方法制备M13 DNA分子，同时又可以采用类似于噬菌体分离纯化方法制备单链M13 DNA，单链DNA在序列测定及定位诱变等中极为有用。
1.1.3噬菌体DNA的分离纯化 培养细菌 加噬菌体侵染细菌 培养细菌 注意裂解 加氯仿 分离DNA PEG沉淀噬菌体颗粒 培养细菌 加噬菌体侵染细菌 培养细菌 注意裂解 加氯仿 分离DNA PEG沉淀噬菌体颗粒 继续培养直到细菌全部裂解
1.3质粒-噬菌体杂合载体 1.3.1柯斯质粒（Cosmids) 它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。包装蛋白识别信号cos位点，与待包装DNA性质无关，因此用一个质粒DNA 取代λDNA，就可大幅度地提高外源DNA片段的装载量。 λDNAcos位点及其附近的DNA片段为1.7kb，质粒DNA为3.0kb,由此构建的Cosmid约为5.0kb, 其最大装载量可达45.9kb。
1.具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染进入受体细胞)； 2.具有质粒载体的特性(易于克隆操作、也能转化进入受体细胞、选择及高拷贝等)； 柯斯质粒的优点： 1.具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染进入受体细胞)； 2.具有质粒载体的特性(易于克隆操作、也能转化进入受体细胞、选择及高拷贝等)； 3.具有较高容量（45 kb）的克隆能力； 4.排斥非重组子； 5.不能体内包装，不裂解受体细胞，不形成噬菌体颗粒，因而不形成噬菌斑。 如果通过进一步的分子分析发现得到的质粒是空载体，为什么？
为什么柯斯质粒慢慢的用的很少或不用了？
1.3.2噬菌粒载体(phagemids) 由丝状噬菌体DNA和质粒组成的杂合分子。 它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞内稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体。优点：A、具有质粒性质，便于外源DNA的克隆及重组子的筛选；B、提高装载量；C、较稳定。
常用的噬菌粒载体pUC18和pUC19 1. 具有较小分子量，可克隆10kb左右的外源DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号便于转化子的选择； 3. 拷贝数高，每个寄主可高达500个，所以只要用少量的大肠杆菌细胞培养物，便可制备出大量的载体DNA； 4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上； 5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可通过化学显色反应，筛选重组子； 6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，这样插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达； 7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子； 8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中； 9. 在pUC18和pUC19这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA； 10. 可以直接对克隆的DNA片断进行核苷酸的序列测定，免去了从质粒载体到噬菌体的这一烦琐的亚克隆步骤。
用于体外转录 T7 T3
1.4其他载体-人工染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段，此时柯斯质粒(45kb)和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区（着丝粒）、稳定区（端粒）与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。
人工染色体载体(artificial chromosome vector)，实际上是一种“穿梭”克隆载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体(大肠杆菌)源质粒复制起始位点(ori)，还含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。 这样的克隆载体在第一受体细胞内可以按质粒复制形式进入高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，可在转化的细胞内按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。 筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素抗性选择标记；而筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补的营养缺陷型。与其他的克隆载体相比，人工染色体克隆载体的特点是能容纳长达1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。
（1）酵母人工染色体YAC(Yeast artificial chromosome) 包含一个染色体在酵母中繁殖所需的三个序列成分：A、 酵母染色体的复制起点；B、一个着丝粒，保证染色体分离进入后代细胞中；C、端粒，染色体末端封合。还有一个克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因以区分载体和重组分子以及大肠杆菌的复制起点。可以接受350-400kb的外源DNA片段。 尿嘧啶合成酶关键基因URA3基因 色氨酸合成酶基因TRP1
(2)细菌人工染色体BAC (Bacterial artificial chromosome) 以F1质粒衍生而来，能克隆约100kb-350kb的外源DNA片段，可以通过转化进入受体细胞，象一般质粒制备原理分离。它在大基因组尤其是植物基因组的研究中发挥重要作用。如构建contig，物理作图等。缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。
2基因工程工具酶 2.1限制性核酸内切酶(Restriction Endonuclease, RE) 在研究寄主细胞对噬菌体的限制-修饰系统中发现，它能在DNA特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。 大肠杆菌B 大肠杆菌K 修饰的phage λ (B) EOP=10-4（限制作用） EOP=1（修饰作用） 修饰的phage λ (K) 寄主的限制与修饰现象 成斑率(EOP, efficiency of plating)
限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制，维护宿主遗传稳定的保护机制。 修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏,宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
表2-1 核酸限制性内切酶类型及主要特性 特性 Ⅱ型 Ⅲ型 Ⅰ型 （1）限制和修饰活性 （2）酶蛋白分子组成 （3）限制作用所需的辅助因子 表2-1 核酸限制性内切酶类型及主要特性 特性 Ⅰ型 Ⅱ型 Ⅲ型 （1）限制和修饰活性 （2）酶蛋白分子组成 （3）限制作用所需的辅助因子 （4）特异性识别位点 （5）切割位点 （6）序列特异的切割 （7）在基因工程中的应用 双功能的酶 3种不同的亚基 ATP、Mg2+ 非对称序列 在距识别位点至少1000 bp的地方随机的切割 不是 无用 核酸内切酶和甲基化酶分开 单一亚基 Mg2+ 迴文对称结构 位于识别位点上 是 广泛使用 2种不同的亚基 ATP、Mg2＋ 非对称序列 距识别位点下游24-26bp处 是 用处不大
限制性核酸内切酶的命名和特征 1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下： 1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。 大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示； 流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。 2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如EcoK, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。 4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。(现已省略)。
Haemophilus influenzae d株中发现的第三个酶 限制性核酸内切酶的命名和特征 eg. EcoRI Escherichia coli R质粒 第一次发现 HindIII Haemophilus influenzae d株中发现的第三个酶
基本特征 ① 识别序列为4、5或6个碱基对且具有180旋转对称的回文结构 4bp HpaⅠ C CGG HaeⅢ GG CC 5bp AvaⅡ G GWCC EcoRⅡ CCWGG 6bp BamHⅠ G GATTC SmaⅠ CCC GGG 11bp Bg1Ⅰ GCCNNNN NGGC 12bp BstXⅠ CCANNNNN NTGC N=A, T, G, C
② 同位酶：识别相同的序列但切点不同。如 XmaI/SmaI 同尾酶：识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。 如 MboI/BglII/BamHI,它们切割DNA之后都形成由GATC 4个核苷酸组成的粘性末端 BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI N GATCN 同裂酶：识别位点和切割位点均相同的酶。如 HpaI/HincII ③ 一般来说，识别序列的碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低；不同生物碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同。
④ 切开的DNA末端有平头末端和粘性末端（双链DNA的一条链突出，如5′或 3′突出末端，在适当的温度下，两个互补粘性末端能退火形成双链分子。 Ⅱ限制性核酸内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中3‘位酯键产生两个末端，末端结构是5’-P和3’-OH，产生3种不同的切口。
5’突出的末端
3’突出的末端
平头末端
2.2 DNA 连接酶 DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应形式是将DNA双链上相邻的3′羟基和5′磷酸基团共价结合形成3′-5′磷酸二酯键，使原来断开的DNA切口重新连接起来，因此它在DNA复制，修复以及体内体外重组过程中起着重要作用。 大肠杆菌连接酶是利用NAD+作为能源的，而T4噬菌体DNA连接酶则是以ATP作为辅助因子。
注：关于“Gap”与“Nick”的概念。 1.Gap裂或缺口：即DNA裂口，是指双链DNA分子上的某一条链失去一个或数个核苷酸时所出现的DNA单链断裂。Gap in DNA is the absence of one or more nucleotides in one strand of duplex. 2.Nick切口：双链DNA分子的单链断裂，即在相邻的2个核苷酸分子之间，失去了(移走了)一个磷酸二酯链。 Nick in duplex DNA is the absence of a phosphodiester bond between two adjacent nucleotides on one strand. Nick and gap? 1.相邻的3′羟基和5′磷酸基团;2.配对;3.需要辅基;4平头末端也可以
2.3 DNA聚合酶和Klenow大片段酶 DNA聚合酶以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3ˊ-OH端而合成新的DNA。大肠杆菌DNA PolymeraseI研究得较清楚，单体，具有5′- 3′的DNA聚合活性， 5′- 3′的DNA外切活性和3′- 5′的DNA外切活性。用蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ产生两个片段，一个小片段，带有的5ˊ - 3ˊDNA外切酶活性，而另一个较大的片段失去了5ˊ - 3ˊDNA外切酶活性但保留了另两种活性5ˊ - 3ˊ聚合酶活性3ˊ - 5ˊ外切酶活性，这个大片段被称为Klenow大片段酶。
2.4 碱性磷酸酶 细菌的碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠的碱性磷酸酶（CIP）均能催化DNA，RNA，核苷酸的5‘端除磷反应，因此在DNA重组实验中，该酶用于载体DNA的5′末端除磷操作以防止载体自身连接，提高重组效率；用于末端标记。 3’ HO- -P 5’ -OH 碱性磷酸酶 P-
防止线性化的载体份子自我连接
2.5 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT） 该酶来源于小牛胸腺，它是一种不需要模板的DNA聚合酶，其合适的底物形式为带有3′游离羟基的双链DNA分子,当底物为3’端突出的双链DNA时，TdT在Mg2+的存在下，即可将脱氧核苷酸随机聚合在两条链的3′端，对于平头或3′凹端DNA底物，则需要Co激活，但聚合反应仍不按模板要求进行.TdT在人工粘性末端的构建中极为有用。
2.6 S1核酸酶(S1,Nuclease) 该酶来源于米曲霉茵，催化反应通常由Zn 2+激活，并在酸性pH（4.0-4.5）条件下进行，其特征是：（1）降解单链DNA或RNA，包括不能形成双链的区域（如发夹结构中的环状部分），但降解DNA的速度大于降解RNA的速度；（2）降解反应的方式为内切和外切；(3)酶量过大时会伴有双链核酸的降解。因为该酶的双链降解活性比单链低7.5万倍，因此在DNA重组及分子生物学研究中，S1核酸酶常用来切平突出的单链末端以及制作S1图谱。 (1)测定真核基因中间隔子序列位置； (2)去除DNA片段中突出的单链尾巴； (3)打开cDNA合成时形成的发夹环结构。
2.7 影响限制性核酸内切酶活性的因素 （1）DNA的纯度 一个限制性核酸内切酶单位u：在最佳缓冲系统中，在37℃下反应1小时完全降解1gDNA所需的酶量。DNA样品中所含蛋白质，有机溶剂以及RNA等杂质均会影响酶切反应的速度和酶切的完全程度，酶切的底物一般是双链DNA，DNA的甲基化位置会影响酶切反应。
大部分II型限制性核酸内切酶需要相似反应条件： Tris-HCl 50mmol/L pH7.5 MgCl2 10mmol/L NaCl 0-150mmol/L DTT 1mmol/L Volume 20-100μL Temperature 37℃ Time 1-1.5h （DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白) 0 - 50 mM 低盐酶 100 mM 中盐酶 150 mM 高盐酶 Buffer
完全消化：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 加大酶的用量，1μg DNA用10U酶 加大反应总体积 延长反应时间 局部消化：只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。
（2）温度 大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37℃，但也有例外，如SmaⅠ的反应温度为25℃, SfiI为50℃ 。降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。 (3)盐离子浓度 不同的核酸限制性内切酶对盐离 子强度（Na+）有不同的要求，一般按离子强度不同分为低(0-50 mM) 、中(100mM)、高盐(150mM)三类。Mg2+也是限制性内切酶酶切反应所需。 (4)缓冲体系 核酸限制性内切酶要求有稳定的pH值环境，这通常由Tris-HCl缓冲体系来完成。另外保持限制性内切酶稳定和活性一般使用-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）和牛血清白蛋白（BSA）.
(5)反应体积和甘油浓度 商品化的限制性内切酶均加50%甘油作为保护剂，一般在-20℃下贮藏。在进行酶且反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶的体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。 (6)限制性内切酶反应的时间 通常为1小时，但大多数酶活性可维持很长的时间，进行大量DNA酶解反应时，一般让酶解过夜。
(七)限制性内切酶星号活性 限制性核酸内切酶有特异性识别序列和切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种识别位点，这种现象称为星号活性。如EcoRI，正常条件下识别GAATTC，但在低盐，高pH和高甘油存在的情况下，能识别并切割AAATTC, GAGTTC, GAATTC 等。 在一个DNA酶切试验中发现样品没有切动，为什么？
第三章基因工程的常规技术 DNA片段 同载体连接 导入受体细胞 筛选 DNA的制备、凝胶电泳、核酸分子杂交、细胞转化、 文库构建、PCR扩增技术、DNA序列结构分析、RNA和蛋白质 制备分析、DNA蛋白质作用分析
3．1凝胶电泳技术 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳，其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyzcrylamide gel electrophoresis,PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸，而琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但在核酸研究中应用广泛，是一个主要的技术。
3.1.1琼脂糖凝胶电泳的原理 ①分离原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中移动时，有电荷效应和分子筛效应。前者由分子所带电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高了分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相对增强而提高分辨率。
②检测原理：溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB就插入DNA分子中形成荧光结合物，使发射荧光增强几十倍，而荧光的强度正比于DNA含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。若用扫描仪检测，只需要5～10 ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如用肉眼观察，可检测到0.05～0.1μg的DNA。
上样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。 上样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。
3.1.2琼脂糖凝胶电泳的条件影响 ①DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 ②随着电场的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小，即分辨 率降低。 ③DNA分子在TAE和TBE等缓冲液中带负电荷，在电场中向正极 移动。 ④琼脂糖浓度。采用不同的凝胶能分辨不同分子量的DNA分 子。 ⑤电场方向。电场方向改变，DNA分子被迫改变路径，DNA分子 越大，为适应新的电场方向而重新排列所需的时间就越长。 因此可以通过脉冲电场凝胶电泳来分辨极大的DNA分 子。
☆能定性定量DNA、能知道DNA分子量，能大约知道DNA的纯度情况。
DNA变性 1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性 2、变性的方法：1）热变性：温度升高到90-100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核 酸分子链 间的氢键断裂。 3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。 DNA复性 1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。 复性过程：1）单链分子间碰撞形成局部双链 2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离 3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列 4）形成完整的双链分子
3．2 核酸的分子杂交技术 3.2.1 探针标记 带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。 ①切口平移标记 控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH末端（这条链即成为引物）。DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nick translation)
②随机引物标记 能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。DNA聚 合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP 为原料合成新的与模板DNA互补的探针。 ☆ RNA的标记、DNA末端标记、PCR标记 ☆ 放射标记和飞放射标记
3.2.2 核酸的分子杂交 ① Southern blot Southern杂交技术由E. Southern 于1975年发明，它现在是基因分离和鉴定中不可缺少的一个重要手段。待分析的基因组DNA或其它DNA首先用一种或几种限制性核酸内切酶消化，消化后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳按照分子量的大小进行分离，凝胶经碱变性处理，将DNA分子变性成单链，经毛细管作用或物理方法将凝胶中的单链DNA分子从胶上转移到固相支持物上（一般使用的是尼龙膜和纤维素膜）。然后用标记的DNA或RNA探针对附着于膜上的DNA进行杂交来检测这些被转移的DNA片段，与探针有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通过特定的检测方法如放射自显影或显色而显示。
Southern blot 原理
Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多原因,其中包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和比活性、转移到滤膜上的DNA量以及探针与目的DNA之间的配对情况等。
一个Southernblot杂交应用的例子： Chromosome constitution of Nullisomic-tetrasomic line Nulli 1A Tetra 1B [NT1A(1B)] C DL-1 DL-2 DL-3 DL: Deletion Line for 1BS Probe A Probe B Probe C 1 2 3 4 5 6 7 A B D Single break terminal deletion lines
Chromosome constitution of ditelosomic 1AL 1 2 3 4 5 6 7 A B D
Fine Physical mapping of group 1 in wheat D A B N1AT1B N1BT1D N1DT1A 1BS-18 1BS-19 1BS-22 1BS-13 1BS-16 1BS-10 1BS-15 1BS-21 1AS-3 1AS-4 1AS-1 1AS-2 1AS-5 1BS-4 1BS-2 1BS-6 1BS-8 1BS-7 1BS-3 1BS-1 1DS-5 1DS-4 1DS-1 1DS-2 1DS-3 1AL-3 CS DT-1DS 1BL-10 1BL-13 1BL-12 1BL-15 1BL-16 DT-1AS DT-1AL DT-1BS 1BL-11 DT-1BL DT-1DL 1AL-4 1AL-5 1AL-2 1AL-1 1BL-3 1BL-5 1BL-8 1BL-9 1BL-2 1BL14 1BL-1 1BL-7 1BL-6 1DL-2 1DL-3 1DL-1 1DL-4 Probe used: BCD921 FL0.42 FL0.17 FL0.47 FL0.32 FL0.41
②Northern blot 和 Western blot 转移RNA，然后进行杂交----------- Northern blot 转移蛋白质，然后进行杂交---------Western blot ③菌落（或噬菌斑）原位杂交 把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌变性并固 定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移 的菌落或噬菌斑。
3.3文库构建 基因文库（gene library)或DNA文库：在细菌中增殖来自某一生物的染色体基因组DNA（或来自所有不同的mRNA种的每一种cDNA分子）所形成的的全部DNA片段之集合体。有基因组DNA文库(克隆)和cDNA文库(克隆)。
基因组DNA克隆(文库） 某种生物总基因组DNA片段和某一载体形成的克隆或文库。 cDNA克隆文库 来自某一生物的某种组织的所有不同的mRNA合成的cDNA分子再将cDNA重组到载体上，导入大肠肝菌细胞增殖。
3.3.1基因组文库 3.3.1.1 DNA克隆片段的产生与分离 ①基因组DNA的片段化 限制性核酸内切酶和机械切割法 ② DNA片段大小分离和富集 琼脂糖凝胶电泳和蔗糖梯度离心技术
3.3.1.2重组DNA导入受体细胞---转化和转染 转化（transformation): 感受态的大肠杆菌捕获和表达外源质粒DNA分子的过程；转染（transfection):感受态的大肠杆菌捕获和表达外源噬菌体DNA分子的过程。 感受态：细菌吸收转化因子的生理状态。
（1）受体细胞的选择 A、限制缺陷型；B、重组缺陷型；C、遗传互补型； D、感染寄主缺陷型 （2）转化过程 感受态细胞的制备 受体细胞和DNA混合 热激 表达 转化子 （3）转化影响因素 A、DNA；B、受体细胞；C、操作
3.3.1.3基因文库的质量 N=ln(1-P)/ln(1-f) N为一个完整基因文库所应包含的重组DNA的转化子克隆数；P为在重组体群体中出现目的基因序列的几率（一般期望值为99％）；f为限制片段的平均大小与基因组DNA大小之比。 比如人单倍体基因组大小为3X109 bp，若载体装载量为20kb,那么为了保证目的基因序列以99％的几率在重组体群体中出现则需要重组子克隆数为69万。
3.3.2 cDNA文库 (1)cDNA文库的构建 A、分离总RNA，然后从中纯化mRNA。 B、合成第一cDNA链。 C、将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子。 D、将合成的双链cDNA重组到载体上，导入大肠肝菌 细胞增殖。
（2）cDNA 克隆的优越性 A、一些RNA病毒基因克隆的唯一手段。 B、文库筛选较简单。 C、假阳性几率低。 D、生产表达产物蛋白质。 E、功能研究。
3.3.3基因克隆的实验方案 A.鸟枪法 某种生物总DNA片段的随机克隆，以及随后对含有克隆的细菌菌落或噬菌斑的鉴别，通常要从几百至几千菌落或噬菌斑中辨别出一个克隆。
B.基因图位克隆（map-based cloning) 用于分离其编码产物尚不知道的目的基因的一种有效方法。条件：有高密度的分子标记遗传图谱和对应的物理图。其原理是：在目的基因的两侧确定一对紧密连锁的RFLP或其他分子标记，接着利用最紧密连锁的一对两侧分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个分子标记之间的含目的基因的特定基因组片段克隆并分离出来，最后鉴定出目的基因。 原理和过程？
(1)RFLP分子标记和作图 RFLP（restriction fragment length polymorphism), 即DNA限制片段长度多态性，它是指应用特定的核酸限制性内切酶切割有关的DNA分子，所产生出来的DNA片段在长度上的简单变化。由于不同来源的植株DNA分子中间已经发生了碱基对的取代，缺失，插入或重排等变化，其中有些变化导致了限制性酶切位点的变动而形成RFLP。
(2)染色体步移（chromosome walking) 根据高密度的分子标记遗传图谱，利用在目的基因的两侧最紧密连锁的一个或一对分子标记作探针，通过筛选基因组文库分离出阳性克隆，以阳性克隆的末端单拷贝序列为探针再筛选基因组文库分离出阳性克隆，并通过DNA指纹分析将分离出的基因组克隆重叠连接在一起形成重叠群。如此重复多次直到克隆重叠群覆盖目的基因。这种技术称为染色体步移。
Fig. Subgenome chromosome walking on chromosome 1AmS Fig. Subgenome chromosome walking on chromosome 1AmS. (A) High-resolution genetic map of the Lr10 locus on chromosome 1AS of hexaploid wheat derived from 3120 F2 plants of a cross between ThLr10 and Frisal. Six of the 12 probes derived from T. monococcum BACs are shown and underlined. The remaining 6 probes were derived from BAC 111I4 and 640L20, and all of them cosegregated with the Lr10 gene. Probe names beginning with an F represent PCR products derived from specific regions of either BAC ends (F640) or shotgun clones (F241, F467). Probe names beginning with HS represent inserts from shotgun clones, which were directly used as RFLP probes. 4E14R is the right BAC end of 4E14 derived by plasmid rescue. Genetic distances are in centimorgans (cM). (B) Physical contig at the MWG2245 locus in diploid T. monococcum (DV92). The total contig length is about 450 kb. Left and right ends of BAC clones are indicated as L and R, respectively. Probes for which the physical location is only approximately known are marked with an asterisk
C.差别杂交 (differential hybridization) 用来筛选特异mRNA的cDNA克隆,它不需要任何有关目的基因的核苷酸序列信息，但需要有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正常表达，而在另一细胞群体中不表达。差别杂交分离目的基因的原理：a、从两种来源的细胞群体制备mRNA； b、用来源于表达目的基因的细胞群体的mRNA逆转录构建cDNA文库； c、用两种细胞群体制备的mRNA逆转录制备cDNA标记探针；
d、用这两种cDNA探针分别对文库进行杂交并比较杂交信号：在含有目的基因的cDNA探针杂交平板上出现的菌落而在不含目的基因的cDNA探针探针杂交平板上不出现，这种菌落即可能是目的基因克隆。
3.4 PCR扩增（Polymerase Chain Reaction)
What is PCR? DNA replication gone crazy in a tube! Makes many copies of target sequence from template DNA Uses heat-resistant Taq polymerase from Thermus aquaticus 又称为聚合酶链反应, 由Mullis于1983年发明，能在体外特异快速扩增DNA片段。组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）
What is needed for PCR? Template (the DNA you want to amplify for the study) Sequence-specific primers flanking the target sequence Forward Reverse Nucleotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Magnesium chloride (enzyme cofactor) Buffer, containing salt Taq polymerase
A、Taq DNA聚合酶 热稳定的聚合酶，1988年分离到。催化一典型的PCR反应所需 酶量约为2单位，加酶量过多则有可能导致非靶序列的扩增。 B、引物 引物是保证PCR特异性的关键因素，一般使用两个引物来扩增 专性序列。设计原则：①长度15-30个核苷酸； ②G+C含量应在 45%-55%； ③碱基分布的随机性；④引物不能含有自身互补序 列；⑤两个引物之间不应有多于4个互补碱基。 引物贮备液浓度一般为20M（或10-50M），使用浓度一般 为1mol/L(1M),这一浓度足以完成30个循环的扩增反应。过 高，不经济且会出现非特异序列扩增及增加引物二聚体的产生；
过低，则PCR的效率低。 C、反应缓冲液 Mg2+: 可显著影响PCR的产量及产物特异性，一般用量为1.5mM。 过高则出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。 明胶，BSA，Tween20及DTT: 对酶有一定的保护作用。 Tris-Cl: PH8.3, 提供缓冲环境。 D、dNTP dATP, dGTP, dCTP 和 dTTP贮备液浓度均为5mM，保存于 -20℃，使用浓度为200M。过低则反应速度下降，过高则特异 性下降。
E、反应条件 变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩 增成功的关键。 复性温度和时间：PCR反应的特异性取决于复性过程中引物 与模板的结合，一般为40-60℃.越高, 产物 的特异性也越高。时间一般为30-60s。 延伸温度和时间：一般位于Taq酶最适作用温度70-75℃之间。 小于1kb的片段一般1-2min就足够了, 而更大 片段需延长时间。 循环数：在25-30个循环内, 扩增DNA增加明显, 以指数方式 增加，后进入相对稳定状态, 此时, ①引物和 dNTP
下降；②Taq酶活性下降；③扩增产物（焦磷酸盐和DNA） 力。所以一味增加循环次数只会增加非特异扩增。
How does PCR work? Repeat multiple cycles Heat (94oC) to denature DNA strands Cool (60oC) to anneal primers to template Warm (72oC) to activate Taq polymerase, which extends primers and replicates DNA Repeat multiple cycles
Denaturing Template DNA Heat causes DNA strands to separate 5’ 3’ 3’ 5’ Denaturation of DNA at 94oC 3’ 5’ 5’ 3’
Annealing Primers Primers bind to the template sequence Taq polymerase recognizes double-stranded substrate 3’ 5’ 3’ 5’ Primers anneal at 60oC 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’
Taq polymerase extends….. Taq polymerase extends primer DNA is replicated 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Extend at 72oC 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ Repeat denaturing, annealing, and extending 40 cycles
The exact-length target product is made in the third cycle 5’ 3’ 3’ 5’ Cycle 1 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ Cycle 2 3’ 3’ 5’ Cycle 3 PCR Projector
PCR技术的应用 A、基因组DNA PCR克隆和cDNA的RT-PCR克隆 B、基因组的RAPD（随机扩增多态DNA分析，random amplified polymorphic DNA)标记分析。使用随机的短核苷酸引物，在 低的退火温度下进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳所呈显的 带型，反映着用作扩增模板的DNA分子的总体结构特征。 C、临床诊断和法医鉴定 如男女性别鉴定，病毒性感染病的诊断，对单根毛发或单个 精子作遗传学鉴定等。 PCR扩增有非专一性的带出现，请问有哪些措施减少或消除它们？
3.5 DNA测序 有两种方法：Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学修 饰法。 ①Sanger 双脱氧链终止法 1977年由英国剑桥生化学家F. Sanger发明。需要：单链DNA模板，适当的DNA合成引物，DNA聚合酶，标记的脱氧核苷酸和双脱氧核苷三磷酸（ddNTP)，并且在四个反应管中进行。 ddNTP 取代dNTP掺入到DNA生长链的末端后，由于ddNTP没有3‘-OH基团，所以链终止。这样反应后电泳分离得到不同的DNA片段谱带图。根据ddATP---T, ddGTP---C, ddTTP----A, ddCTP---G读序列胶得到DNA的序列。见原理图。
脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较
② Maxam-Gilbert化学修饰法 1977年由美国哈佛大学A.M.Maxam和W.Gilbert发明。基本原理：用化学试剂处理具末端放射标记的DNA片段,造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA片段，电泳分离，放射自显影，读胶确定DNA序列。化学试剂硫酸二甲酯作用鸟嘌呤和腺嘌呤，但控制反应的温度和时间，可以选择性地断裂鸟嘌呤而不降解腺嘌呤。化学试剂肼作用胸腺嘧啶和胞嘧啶，但在高浓度盐下，只选择性地破坏胞嘧啶。
3.6 DNA芯片 DNA Microarrays cDNA Oligo Genomic Affymetrix
预制的基因芯片 全自动芯片洗涤工作站 高分辨率的芯片扫描仪 芯片滚动杂交仪 智能化的分析软件
GeneChip的操作流程 L 杂交混合液的制备 杂交 L 标记的cRNA片断 洗脱 染色 Control Oligo B2 Eukaryotic Hyb.Control Control Oligo B2 Test3 or GeneChip 杂交 （16hour） L 标记的cRNA片断 洗脱 染色 Array cRNA Target Hybridized Array SAPE conjugate
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