吕梁高等专科学校生命科学系 生物实验教学中心 2009.06 细胞生物学实验 吕梁高等专科学校生命科学系 生物实验教学中心 2009.06

实验一 细 胞 凝 集 反 应 一、实验目的： 1. 学习制备土豆凝集素 2. 掌握细胞凝集反应的实验方法及细胞凝聚的原理。 3. 观察凝集的现象 Company Logo

二、 实验原理 ①细胞质膜外表面的一层黏性多糖物质构成的细胞全委会被在细胞间的联系和识别、细胞的生长分化、免疫反应及肿瘤发生等过程中发挥着重要作用。 　 ②动物细胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖链伸向膜表面，它们是细胞识别、细胞免疫及细胞接触抑制现象的必要组分。　　

③凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。 　　④凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。

三、实验仪器 显微镜、粗天平、载玻片、滴 管、 离心管、离心机等. Company Logo

四、实验材料 鸡血 细胞 土 豆 块 茎

用天平称取去皮的土豆块茎2g+10mlPBS缓冲液，浸泡2h→粗提液中含有可溶性土豆凝集素。 五、实验内容与实施过程 1.凝集素粗提液制备（50分钟）： 用天平称取去皮的土豆块茎2g+10mlPBS缓冲液，浸泡2h→粗提液中含有可溶性土豆凝集素。 2.鸡红细胞悬液制备（35分钟）： 以无菌方法抽取鸡血注射器中抽取3.8%柠檬酸钠1ml抽取鸡静脉血液2ml，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2%红细胞液。

实验内容与实施过程 3.细胞凝集反应现象的观察与讨论（50分钟）：用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍显微镜下观察血 球凝集现象。 本实验过程很简单，只需要将植物凝集素与红细胞混合后用低倍显微镜观察现象即可。 具体如下： 实验组 凝集素1滴 红细胞悬液1滴 对照组 PBS液1滴

实验内容与实施过程 4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共150分钟。

实验作业 1.细胞间凝集的原理是什么？ 2.简图表示血细胞凝集原理

实验总结 1.为什么对照组有PBS液作对照呢？ 没什么巧，因为凝集素中本身含PBS缓冲液，当含本身凝集素是不含PBS的，只是因为本实验中凝集素的提取时用到了PBS.

实验总结 2.那么红细胞悬液是怎么制备的呢？ 其实也不难，无菌抽取动物静脉血液，当然血液抽出来后肯定要先加抗凝剂了，然后再加生理盐水。那么怎么从血液中将红细胞分离出来呢？想想，血液中有血清、红细胞、白细胞和血小板，按道理来讲红细胞应该最重吧(有待查证)，用离心机在2000r/min下离心5min，去掉上清液，得到的应该就是红细胞了，再加适量生理盐水洗涤几次后，加一定量是(按压积红细胞体积算)生理盐水即可配成相应浓度的红细胞悬液了。

备注 凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质,被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。

了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 实验二 细胞膜的渗透性 一、实验目的： 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。

二、 实验原理 细胞膜为一种半透膜，对物质的通透具有选择性。当红细胞放入低渗溶液中时，细胞吸水膨胀而发生溶血。 当红细胞放入含不同溶质的等渗溶液中时，由于细胞膜对不同溶质的透性不同，细胞发生溶血的时间也会不同，故发生溶血现象时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。

三、实验仪器 离心机 移液枪 试管架 试管

四、实验材料 鸡 血 细 胞 鸡 血

五、实验内容与实施过程 1.鸡血细胞悬液的制备：一份鸡血+10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。 2.低渗溶液：一支试管中，加入10ml蒸馏水+1ml稀释的鸡血，观察溶液颜色的变化？

实验内容与实施过程 3.鸡红细胞的渗透性观察： 在10种等渗溶液中观察细胞溶血现象及时间。

实验内容与实施过程 4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。

实验作业 将观察到的现象列入下表，对实验结果进行比较和分析。

实验作业 试管编号 是否溶血 时间 结果分析 1.10ml氯化钠+1ml稀释羊血 2.10ml氯化铵+1ml稀释羊血

实验总结 溶血时间及现象的观察比较困难，可采用离心辅助的方法来判别鸡血在哪些等渗液中最易溶血，哪些较慢，做一些定性的分析。经过离心之后，若上清液无色，证明在这个时间段血细胞没发生溶血，若上清液略红，证明有溶血发生。当然这个方法不很精确，但却快速、便于观察。

备注

实验三 线粒体和液泡系的 超活染色与观察 一、实验目的： 1.观察动、植物活细胞内线粒体和液泡系的形态、数量及分布； 实验三 线粒体和液泡系的 超活染色与观察 一、实验目的： 1.观察动、植物活细胞内线粒体和液泡系的形态、数量及分布； 2.掌握细胞超活染色技术及原理； 3.学习一些细胞器的超活染色技术。

二、 实验原理 ①活体染色：应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些细胞结构而又很少影响细胞生命活动的染色方法。 ② 中性红：中性红对高尔基体、液泡系的染色具有专一性。只将活细胞中的液泡系当成红色，细胞核与细胞质完全不着色(这可能与液泡系中某些蛋白质有关。

③詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，即有色状态，呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态

三、实验仪器 显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。

四、实验材料 洋葱、小麦种子或黄豆幼根根尖 人口腔上皮细胞

五、实验内容与实施过程 1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上 ↓ 滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液 ↓ 用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞 ↓ 刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中 ↓ 染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液) ↓ 盖上盖玻片,显微镜下观察

实验内容与实施过程 2. 植物细胞液泡系的超活染色与观察 取小麦种子发芽的根尖 用刀片纵切根尖 放入中性红染液滴中，染色5～10min。 吸去染液，滴一滴Ringer液 盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察)

实验内容与实施过程 3.实验结果 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。

实验内容与实施过程 4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。

实验作业 （1）绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布 （2）绘小麦根尖细胞示液泡的形态与分布

实验总结 人口腔上皮细胞的线粒体的超活染色与观察效果很好，但是洋葱表皮细胞和小麦根尖细胞的染色效果不是很理想。

备注

实验四 叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的： 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法； 实验四 叶绿体的分离与荧光观察 一、实验目的： 1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法； 2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。

二、 实验原理 组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

三、实验仪器 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。 烧杯2个, 250ml量筒1个, 滴管20支, 10ml刻度离心管20支, 试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。

四、实验材料 新 鲜 菠 菜

五、实验内容与实施过程 （一）叶绿体的分离与观察 1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。 2. 利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。 3. 将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。 4. 取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。 5. 将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。

③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。 实验内容与实施过程 6. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。 7. 取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。 ①在普通光镜下观察。 ②在荧光显微镜下观察。 ③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。

实验内容与实施过程 （二）实验结果： ①普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。 ②在选用B（blue）激发滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。 ③加入丫啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。

实验内容与实施过程 (三)实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。

实验作业 1.在分离叶绿体时应注意些什么问题？ 2.在倒置显微镜相连的电脑软件支配下，测量一下叶绿体的长轴和短轴，分别测量5~10个叶绿体，求其平均值。

实验总结 实验结果非常理想，提醒学生们在使用荧光显微镜时应注意保护眼睛，避免紫外线的伤害。

备注

实验五 植物原生质体的分离与培养 一、实验目的： 实验五 植物原生质体的分离与培养 一、实验目的： 原生质体是除去细胞壁的裸露细胞。在适宜的条件下，分离的原生质体能够再生细胞壁，进行细胞分裂，并再生完整植株。通过实验，掌握原生质体分离和培养的基本方法，并对培养结果进行观察和分析。

二、 实验原理 ①植物原生质体是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”，是开展基础研究的理想材料。其中酶解法分离原生质体是一个常用的技术，其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁而使原生质体释放出来。　

②原生质体分离纯化或融合后，在适当的培养基上应用合适的培养方法，能够再生细胞壁，并启动细胞持续分裂，直至形成细胞团，长成愈伤组织或胚状体，再分化发育成苗。其中，选择合适的培养基及培养方法是原生质体培养中最基础也是最关键的环节。

三、实验仪器 台式离心机、 高压灭菌锅、倒置显微镜、超净工作台 台式离心机、 高压灭菌锅、倒置显微镜、超净工作台 三角瓶、离心管、烧杯、200目不锈钢滤网、解剖刀、长、短镊子、培养皿、滤纸、0.2μm滤膜、滤器、培养瓶（注：以上用品要进行高压灭菌）

四、实验材料 新鲜菠菜的叶 烟草幼苗的叶片

五、实验内容与实施过程 1、实验原理的讲解；（15分钟） 2、液体培养基的配制；（实验前由教师完成） 3、酶液的制备：（20分钟） 1％纤维素酶、1％果胶酶、0.6mol/L甘露醇 、0.1%MES、0.05mol/LCaCl2·2H2O、 pH6.8—7.0

4、植物原生质体的分离和培养（ 课内完成，180min） 实验内容与实施过程 4、植物原生质体的分离和培养（ 课内完成，180min） ①取充分展开的嫩叶，用自来水冲洗干净； ②将叶片在0.1%升汞溶液中浸泡灭菌10min，然后用无菌蒸馏水漂洗5次； ③用镊子撕去叶的下表皮，然后将叶放有酶液的培养皿或带盖三角瓶，每10ml酶液放2g叶片；

实验内容与实施过程 ④在25～28℃黑暗条件下，酶解2～3h,用200目网过滤除去未完全消化的残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清。加入3～ 4ml 0.2mol/LCaCl2·2H2O洗液，用注射器向离心管底部缓缓注入20％蔗糖溶液6ml，在1000rpm条件下离心5—10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体漂浮在20％的蔗糖与0.2mol/LCaCl2·2H2O之间，破碎的细胞残渣沉入管底。

实验内容与实施过程 ⑤用200μl移液器轻轻将状态好的原生质体吸出(注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液)，放入另一干净的离心管中．加4ml 0.2mol/LCaCl2·2H2O悬浮，1000rpm离心2～5分钟，弃上清．

实验内容与实施过程 ⑥将收集的原生质体悬浮在适量的DPD培养基中，用血球计数板调整原生质体密度为5×104/ml（请参考细胞计数）之间。 ⑧用石蜡膜带封口。置26℃左右条件下进行暗培养。

实验内容与实施过程 5、培养结果的观察（活力检查，细胞壁再生的观察，细胞分裂的观察）:在课外由教师指导学生进行.

实验内容与实施过程 6、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共225分钟。

实验的意义 植物原生质体融合和培养在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。 它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远缘杂交有性不亲和障碍，也可克眼传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远缘基因导入栽培种中，原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。

实验作业 1．酶解液及原生质体起始培养基中，为何要保持较高渗透压？ 2.如何判断分离原生质体的活力和新壁再生？

实验总结 将原生质体培养分化过程进行显微摄影，并分析结果。以植物根、茎、叶、叶柄作为原生质体的分离材料,经过分离收集在一定条件下才能培养获得完整的原生质体,原生质体培养基的渗透压应与酶液的渗透压相等.

备注

实验六 动物血细胞的电融 合技术 一、实验目的： 本实验使学生在了解电融合原理的基础上，学会掌握各种细胞悬液的制备及电融合过程的操作。

二、 实验原理 制备的游离细胞或原生质体，置于电融合室中，在高频交流电场的作用下，细胞被极化，成为偶极子，造成细胞之间相互连接，如果施加的高频交流电压(即正弦波的p-p值)过高或作用时间过长，则细胞连接成串珠状，应适当控制以上条件，尽量使两细胞处于点接触状态，然后施加方波脉冲予以刺激，由于电脉冲的瞬间作用，可击破两细胞接触点部位的质膜，此时质膜的脂类分子发生重组，同时由于细胞表面的张力作用，使两细胞融合逐步完全。

动物的游离细胞在电刺激下可进行细胞融合，且具有融合率高、无毒性、操作简便及融合后的细胞继续培养成活率高等特点，是细胞工程手段的又一进展。

三、实验仪器 CRY-3型细胞融合仪、细胞融合池、倒置显微镜 刻度离心管、移液枪、血细胞计数板

四、实验材料 鸡 血 细 胞

五、实验内容与实施过程 （一）动物血细胞的制备 （二）细胞电融合 （三）实验结果 （四）实验小结

实验结果 在倒置显微镜下可观察到由同种细胞融合形成的细胞，称为同核体 (homokaryons). 利用不同亲本的不同细胞彼此融合所形成的细胞，称为异核体 (heterokaryons)，还可观察到3个以上细胞融合在一起的合胞体。 返回

实验内容与实施过程 （四） 实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共180分钟。 返回

实验作业 1.绘图表示所观察到的融合细胞 2.请写出细胞电融合的注意事项

实验总结 影响细胞电融合因素： 用于供原生质体或动物细胞悬浮的介质，必须满足两个条件：一是为了保持细胞的生物活性，使融合后的细胞能继续存活，并通过培养能继续分裂和分化，其介质要求与细胞本身具有等渗性；

实验总结 二、是为了保证融合之前所施加的各项电参数充分发挥作用，其介质应具有高纯度的非离子溶液，如果在溶液中存在Na+、 K+、Ca2+等金属离子或Cl离子，将使介质的导电性增加，当施加脉冲波刺激时，据报导，其总能量Q将通过离子的传导作用损失80％以上，而直接通过细胞，用于击穿膜接触点使其细胞融合的能量仅占10—20%，当有离子存在并使电脉冲能量高度损失的情况下，将不能保证细胞进行融合。

实验总结 在介质中有金属离子存在，当施加高频正弦波电场时，不能将细胞极化成偶极子，从而不能使细胞间相互接触和连接，更谈不上细胞间相互融合。 为了解决以上存在的问题，一是采用高纯度的蒸馏水(三蒸水或四蒸水)来配制介质，二是选用适当的非电介质溶质．如甘露醇、山梨醇或蔗糖等来配制供细胞悬浮的等渗溶液，另外，在清洗电融合室时，以要以高纯度的蒸馏水用毛笔擦净。

备注 电融合发展于20世纪80年代，是使细胞在电场中成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，膜的脂类分子发生重排，由于表面张力作用，两细胞发生融合。

实验七 利用PEG为媒介 物进行动物血细胞融合 一、实验目的： 掌握利用聚乙二醇为介导物对各类细胞的融合方法．

二、 实验原理 聚乙二醇分子能改变各类细胞的腆结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合。

三、实验仪器 离心机、 恒温水浴锅 电热套 倒置显微镜

四、实验材料 鸡 血 细 胞

五、实验内容与实施过程 （一）动物血细胞的制备 （二）细胞电融合 （三）实验结果 （四）实验小结

实验过程 一、溶液配制 1、Alsver液(同前) 2、0.85％生理盐水液 3、GKN液 NaCl8g、KCl0.4g、NaH2P04·2H20 1.77g、NaH2P04· H2O0.69g、葡萄糖2g，酚红（phenolrad）0.01g，溶于1000ml重蒸水中。 4、50％PEG液的配制

实验内容与实施过程 二、融合方法  1、取制备的鸡红细胞(制备方法同实验六)悬液lml，加入4min0.85％生理盐水，混匀后以1000-1200r/min离心5min，去上清液后．再以上述条件离心洗涤两次(5min、10min)，如果采用各种瘤细胞，只将洗涤液改为0.9的生理盐水，其它条件同上。

实验内容与实施过程 2、将最后一次离心沉降的鸡虹细胞或有关瘤细胞（去上清液）加入2—3mlGKN液，混匀后待用。 3、取以上悬液，用血细胞计数法计数，再以GKN液将鸡红细胞稀释成每毫升含2×10(5)个，瘤细胞每毫升含1.5×l0 (5)个。

实验内容与实施过程 4、如做同种细胞间融合，可取有关细胞悬液1ml,加入50%的PEG液混匀，置于30℃水浴内温育lO~15min；

实验内容与实施过程 （四） 实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共120分钟。

实验内容与实施过程 (五)实验结果的观察 同核体 异核体

实验作业 1.计算融合率？ 2.如何改进该试验，来提高细胞的融合率？请查阅新近的文献。

实验总结 应用化学融合剂PEG进行细胞融合时，通常以GXN液作为稀释剂，一般使用浓度都在50％左右，对细胞的毒性作用较大，虽然在融合后马上进行洗涤，但融合后经过培养阶段，融合细胞的存活率仍然很低．

实验总结 我们的实验证明，有条件如果在0.6mol/L的甘露醇作溶剂，配制成6％--8％的PEG（Mw=000）作为细胞悬液，再按上述条件进行电融合实验，其融合速度和融合事与不加PEG相比都有提高． PEG有毒性，提醒学生在操作过程中一定要注意，避免沾上皮肤。

备注 PEG的型号有很多种，200~6000，分子量大小会影响到不同细胞的融合，一般植物原生质体用6000Da，动物细胞用4000Da。