西北农林科技大学 .干细胞研究中心 西北农林科技大学 .动物医学院 基因芯片对生物学研究进展的影响 西北农林科技大学 .干细胞研究中心 西北农林科技大学 .动物医学院

对基础学科发展的影响 DNA测序：杂交测序（SBH）； 基因表达分析； 基因组研究：作图、测序、基因鉴定、基因功能分析； 基因诊断：寻找和检测与疾病相关的基因及在RNA水平上检测致病基因的表达； 药物研究与开发。 食品卫生安全

芯片技术用于基因序列测定 第一代的杂交测序； 第二代的合成测序-单/四核苷酸循环； 第三代的纳米芯片测序技术；

传统的基因测序方法 测序时分成四个单独的反应，每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸(称为ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP), 然后进行聚合反应。在聚合反应过程中，ddNTP 和dNTP会随机性的结合，一旦ddNTP加入了新合成的DNA链, 由于其3位的羟基变成了氢,不能形成磷酸二酯键，所以不能继续延伸。由此产生A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA 序列。

尿素变性的PAGE电泳胶

杂交测序原理 基因芯片的测序原理是杂交测序，即通过与一组已知序列的核苷酸探针进行杂交完成核苷酸 序列 测定。用图5-9说明测序原理。在一块基片表面固定已知序列的八核苷酸探针，当溶液中带 有荧光标记的核苷酸序列TATGCAATCTAG与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补杂交时， 通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核 苷酸待测序列。DNA芯片测序技术包括芯片制备、样品制备、分子杂交、检测分析、序列 分析和组装等过程。

杂交测序原理示意图

新一代的测序原理 关键的技术点： 核苷酸序列的接头技术； 四种核苷酸的标记技术； 接头与片基的结合技术； 高通量的电脑分析技术； 高效序列分析拼接软件；

第一步，基因组被打断为100-200bps的片段

每个片段被接上接头序列

接头后的片段在片基上固定

对应链的边合成边测序 一个芯片上，1000，000点样，一次测定可以循环30次；耗时5个小时； 从理论上讲，5个小时可以完成30,000,000个碱基的测序量; 工作人员一天就可以完成60,000,000个碱基的测序量;从理论上讲,50个工作日就可以完成一个人的全基因基因测序任务。

该方法的优势： 1. 高通量：一轮反应可产生大于1Gb的数据； 2. 快速：产生1Gb数据的时间约为3天； 3 3美元；

两代测序方法，测序序列都是在荧光或者化学发光物质的协助下，通过读取DNA聚合酶或DNA连接酶将碱基连接到DNA链上过程中释放出的光学信号而间接确定的，除了需要昂贵的光学监测系统, 还要记录、存储并分析大量的光学图像，这都使仪器的复杂性和成本增加，依赖生物化学反应读取碱基序列更增加了试剂、耗材的使用。

新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，因而可以在此基础上使用多种方法来进行高通量检测。此外，纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，所以测序的准确度非常高。对于长达1,000个碱基的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜、快速地进行DNA测序成为可能。如果对现有纳米孔测序法进行进一步发展和改进，那么它将有望成为第三代测序技术（也可称为下、下一代测序技术），从而帮助人们实现24小时内只花费1,000美元完成二倍体哺乳动物基因组测序这一目标。

2008年开始的第三代测序技术则是基于纳米孔的单分子读取技术，这种方法读取数据更快、有望大大降低测序成本，改变个人医疗的前景。第三代测序技术的基本原理是在纳米孔中配置纳米电极，用电测方法测量一个DNA的核酸碱基排列。但是电测识别一个分子的技术开发极其困难，因此尚未有验证该原理的实例。 孔道蛋白：是金黄色葡萄球菌α溶血素； 纳米孔道的电位测量；

表达谱芯片的应用 基因表达谱芯片的应用最为广泛，技术上也最成熟。这种芯片可以检测整个基因组范围的众多基因在mRNA表达水平的变化。它能对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同生理病理、不同刺激条件下的组织细胞内基因表达情况进行对比分析。从而对基因群在个体特异性、组织特异性、发育特异性、分化特异性、疾病特异性、刺激特异性的变化特征和规律进行描述，

进一步阐明基因的相互协同、抑制、互为因果等关系。有助于理解基因及其编码的蛋白质的生物学功能，并从已知生物学功能的基因推论未报道基因的生物学意义。同时，还可在基因水平上解释疾病的发病机理，为疾病诊断、药效跟踪、用药选择等提供有效手段。 急性白血病、黑色素瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等表达谱芯片的研究。

基因芯片的优点： 高通量 大规模 高度平行性 快速高效 高灵敏度 高度自动化

组织芯片 不同的癌组织芯片； 病理组织切片； 不同器官来源组织芯片；

蛋白芯片(protein chip) 蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。 Telechem International Inc ArrayIt 生物芯片的设想最早起始于80年代中期, 90年代美国Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成,　这是一项融微电子、微机械、化学、物理、计算机技术等于一体,是生物学技术与其它学科相互交叉和渗透的产物. 生物芯片(B iochip)是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、DNA、蛋白质、组织、糖类及其他生物组分进行快速、敏感、高效的处理和分析 DNA芯片 与蛋白芯片最大的区别是靶分子和探针分子的结构差异 相对于DNA 芯片, 蛋白质芯片技术面临更多困难。第一, 相对于DNA 的碱基配对杂交机制, 蛋白质之间的相互作用呈现出更强的变化性。而且, 蛋白质的活性以及相互作用的性质可能需要其它蛋白质的作用和翻译后修饰。第二, 相对于PCR 技术这样可以大量扩增DNA 的技术, 尚未有可以大量扩增蛋白质的成熟技术。第三, 蛋白质的表达和纯化工作十分艰巨, 而且经常不能保持蛋白质的完整功能。最后, 许多蛋白质很不稳定, 给阵列制作本身带来很大的困难。 多数蛋白芯片通过接触印记合成，大于30 000 点的高密度阵列可以通过已有的DNA 的点样设备来实 点间距为4. 5mm,点的直径250um,可以检测250nmol或l0Pg的待测蛋白质

研究蛋白质芯片的意义 蛋白质是基因表达的最终产物，接近生命活动的物质层面； 探针蛋白特异性高、亲和力强，可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测； 适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物； 有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。 它以蛋白质检测目的物,蛋白质是基因表达的最终产物,因而它比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面, 由于蛋白质芯片的探针蛋白特异性高、亲和力强,所以对生物样品的要求较低,故可简化样品的前处理,甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测 同时,由于疾病的发生、发展与某些蛋白质的变化有关,所以利用蛋白质芯片还可直接筛选出与靶蛋白作用的化合物,从而大大推进药物的开发. 此外,蛋白质芯片有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用,从而促进药物学和毒理学研究的发展. 蛋白质芯片能同时检测生物样品中与某种疾病或环境因子损伤可能相关的全部蛋白质含量的变化情况即表型指纹,对监测疾病的进程和预后及判断治疗效果有重要意义.

蛋白质芯片的分类 蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 蛋白质芯片依照应用领域不同可分为两类: 蛋白质检测芯片和蛋白质功能芯片。 据检测方法不同可以进一步分为正相蛋白质检测芯片和反相蛋白质检测芯片 正相蛋白质检测芯片首先用不同的荧光标记物对样品中的拟研究的蛋白质进行标记, 再将这些样品在抗体微阵列上进行温育, 然后用生物芯片扫描仪检测各个阵列分子点上荧光信号。正相蛋白质检测芯片可以同时对同一样品的不同成分进行分析对比。但是需要注意在许多情况下, 蛋白质倾向于形成多蛋白质复合体, 所以如果出现很强的信号, 那么可能是由于蛋白质的浓度很高, 或是由于形成了大的蛋白质复合体。 反相蛋白质检测芯片 是用破碎的微量组织或者细胞样品点样制成的芯片, 代表在某种状态下整个细胞的蛋白质,然后用特定抗体进行检测。反相蛋白质检测芯片可以检测许多组织、细胞裂解液, 可以研究整个蛋白质组随时间的波动变化状态, 尤其是通路中的蛋白质何时被修饰、何时被激活。这种芯片检测的优点在于样品需要量小且不需要进行标记, 只需要检测抗体即可。然而它的缺点也在于此, 低点样量可能造成低丰度的蛋白质信号漏检 寻找与拟研究蛋白质相互作用的蛋白质、小分子, 或者寻找对蛋白质进行修饰的修饰酶, 以及寻找酶的底物等等 脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊，目前脂质体已应用于研究蛋白质与生物膜的相互作用、生物膜中离子的转运、药物与膜受体作用、酶催化活性模拟、包载药物、基因转移等方面。

蛋白质芯片的制备 固相载体及其处理 固定微阵列上的蛋白样点 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片） 膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h 蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解 点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等 固定微阵列上的蛋白样点 膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白 微阵列的封闭主要封闭试剂：BSA或Gly 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解,保持在整个制作过程保持水合状态，维持生物活性 接触型点样仪适用于普通玻片, 喷射型点样仪适用于3D 表面和纳米井表面。使用电子喷雾贮存技术将干燥的蛋白质点样到有葡聚糖的表面, 可将点样直径从150 微米缩小到30 微米。 Gly 甘氨酸 光刻法主要是利用半导体持术,在合成碱基单体的5’- 羟基末端连接 上一个光敏保护基,利用光照射使羟基脱保护进行DNA的合成,在生长的链上加上一个碱基。 压电技术利用喷墨打印将毫微升积的试剂喷印到芯片的特定位点,利用电流将分子运送到固 相的表面,一个XYZ三维移动装置指导喷印头的定位。点样法则伪造与微阵列的直接表面接 触,利用由微点样针、毛细管或镊子组成的打印头将准备好的样品从样品槽中转移到固相的表 面。

蛋白质芯片检测 无探针标记检测法 探针标记检测法 表面增强激光解吸离子化技术 同位素标记检测 荧光标记检测 (Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI) 表面等离子体共振检测技术 （surface plasmon resonance, SPR） 原子力显微镜检测技术 （atomic force microscope, AFM ） 同位素标记检测 荧光标记检测 化学发光检测 酶免疫标记检测 胶体金标记检测 荧光标记的芯片采用激光共聚焦显微镜进行扫描，然后通过计算机分析出每个点的 平均荧光密度。 对酶标记的芯片，显色后用高精度的CCD扫描仪进行扫描 一旦荧光标记样品和微阵列反应后,未结合的成分就可洗去,结合到芯片的样品可通过荧 光检测装置进行检测。聚焦扫描仪和CCD相机均已成功地应用于芯片的检测。聚焦扫描仪 和CCD检测系统间一个关键性的不同点是后者经常使用连续波长的光源和弧灯,避免使用多 个激发器。一旦从芯片发出的荧光转换成数字输出后,数据文件就被定量和翻译,通过重叠芯 片像线栅,用软件对芯片上的每个点计算平均密度值,从而完成定量,通过对芯片上实验点和 对照点的比较,光密度值再进一步转换成生物相关的数据输出, 但是标记分子可能降低蛋白质的活性, 或者影响检测效果, 所以最好是不进行标记 SELDI技术是一种基于MALDI－TOF质谱发展起来的全新的检测技术，通过该技术可以很容易的获得与芯片上分子发生相互作用的样品分子的质量信息，由于样品分子被离子后是通过TOF（即飞行时间质谱）进行检测的，其分子量检测的范围从1000到30万Da分子量都可以实现。 SELDI 技术虽易于操作,可检测出不同样品的全部蛋白质的差异, 但是它不能检测高分子量蛋白质和膜蛋白质, 而且灵敏度比起免疫夹心法要低得多。 SPR是通过检测附着在金属薄膜表面的介质折射率的变化来获得与芯片表面分子相互作用的样品分子的信息的。当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，SPR谱（共振角的变化vs时间）能够很灵敏的反映与金属膜表面接触的体系的变化。 该技术的最大优点是：能实时、连续监测反应动态过程 原子力显微镜是利用原子之间的范德华力作用来呈现样品的表面特性。 下面通过一个实例来解释一下原子力显微镜的基本原理是：如图所示，激光器发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂背面，并从微悬臂背面反射到检测器。微悬臂末端固定有特异性的抗体分子，在样品扫描时，由于样品表面的原子与微悬臂探针尖端的抗体分子间的相互作用力，微悬臂将随之发生弯曲起伏，反射光束也将随之偏移，因而，就能获得被测样品与抗体的相互作用信息。其检测范围可以达到nm级。 AFM技术可以通过检测芯片表面高度变化来揭示蛋白质之间的结合与否。 扫描探针显微镜以其分辨率极高（原子级分辨率）、实时、实空间、原位成像，对样品无特殊要求（不受其导电性、干燥度、形状、硬度、纯度等限制）、可在大气、常温环境甚至是溶液中成像、同时具备纳米操纵及加工功能、系统及配套相对简单、廉价等优点 描速度受到限制， 测效率较其他显微技术低；由于压电效应在保证定位精度前提下运动范围很小（目前难以突破100μm量级），而机械调节精度又无法与之衔接，故不能做到象电子显微镜的大范围连续变焦，定位和寻找特征结构比较困难；

蛋白质芯片的应用 疾病诊断和预警 药物开发 蛋白质组学

定量检测组织提取液中的肿瘤标记物 疾病诊断 孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原 微阵列方法与ELISA方法检出结果比较 uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子 VEGF 血管内皮生长因子 9*5阵列， 间隔600um ,喷墨技术 对50个乳癌核心组织切片样品进行 pG/mL检测限 人类约30，000个基因，编码30，000个蛋白。细胞内的蛋白分子量范围：10-125kDa Zhu 等[18]用含有5 800 个不同的酵母重组蛋白质的蛋白质芯片进行实验, 微阵列方法与ELISA方法检出结果比较

高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂 药物开发 His6-RB/GST-E7相互作用抑制剂筛选微阵列图 加入His6-RB 通过直接的相互作用，由人乳状瘤病毒产生的E7蛋白诱导眼癌抑制因子RB下降，表明阻碍二者相互作用的分子可能成为一种抗癌 加入含 PepC抑制剂的His6-RB A 1500 个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及SPR信号

蛋白质芯片在蛋白质组学中的应用 （1）疾病的蛋白质组研究 对肿瘤特异性生物标志物的检测； 在糖尿病及心血管疾病方面的应用； 通过比较正常与病理条件下细胞或组织中蛋白质在表达量上的差异，可以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白。作为疾病诊断的生物标志物，认识发病机制，为早期诊断治疗和预防提供线索，对疾病进程进行监测与控制。 对肿瘤特异性生物标志物的检测； 在糖尿病及心血管疾病方面的应用； 对类风湿性关节炎生物标志分子的检测； 对人类细胞因子和趋化因子的测定和定量分析。

蛋白质芯片在蛋白质组学中的应用 （2）病原微生物的蛋白质组研究 病原微生物蛋白质组研究对于阐明感染性疾病的发病机制，实现有效的预防，早期诊断和治疗，制备新的药物等方面有着重要意义。 （3）在药物开发中的应用 在病理状态下表达异常或特异性表达的蛋白质，以及细胞信号传递通路中的关键性蛋白质，都可能成为药物设计的靶分子。 （4）毒理学分析 通过发生损伤的组织器官与正常组织器官之间的蛋白质组比较，有助于阐明药物毒副作用的发生机制。

人动脉平滑肌细胞蛋白谱 检出298个蛋白 蛋白质组学 4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相互作用分子）表达上调； 54个蛋白表达量发生变化 13.4%抗原（结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降 378 antibodies chip 密度脂蛋白胆固醇特别是氧化的低密度脂蛋白胆固醇及自由基都能刺激某种钙 离子通道的开放,促进钙离子进入血管平滑肌细胞和内皮细胞,而较高的细胞内钙离子浓度反 过来又能增加脂质过氧化物等自由基的产生 细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱 揭示了oxidized low density lipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式

存在的问题 成本过高，需一系列昂贵的尖端仪器 芯片的标准化问题 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等 但是,蛋白芯片技术还只是在研发阶段,并没有转化为商品进行大量的使用,是因为该技术仍存在许多问题. 成本过高,目前的生物芯片技术需一系列昂贵的尖端仪器,如光刻机器、和激光共聚焦显微器等设备, 如Affymetrix的一套系统需要13. 5万美元,对普通的实验室来说开支较大,是生物芯片技术推广的一大障碍. 其次是芯片的标准化问题,即如何将不同实验室、不同操作人员做出的结果进行统一化、标准化, 如何提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等,这些都是亟待解决的问题

染色质免疫沉淀芯片（Chip-Chip） ChiP-on- chip是染色体免疫共沉淀与芯片技术的结合，用于分析在活体细胞中调节蛋白与基因组DNA之间的相互作用。该技术能够快速在目标基因组的染色体中确定特异DNA结合蛋白的准确结合位点，ChIP芯片也可以在一个基因组的任何感兴趣的区域内寻找染色体的结构改变。 一、ChIP-Chip的用途 （1）在基因组范围内确定基因转录因子的DNA结合位点和其他DNA结合蛋白或蛋白复合体的DNA结合位点。 （2）染色体活性状态的定量分析。 （3）组蛋白修饰的功能研究。通过用酰基化或甲基化的组蛋白的特异抗体和没有进行修饰的组蛋白的特异抗体，可以确定与组蛋白修饰有关的结合模式的变化。 （4）聚合酶活性的定量分析。 （5）精炼生物信息方法，用功能数据来确定启动子的位置。

交联与裂解细胞 超声破碎 与基因组信息比对 免疫共沉淀 测序得到序列信息

ChIP-on-chip技术能为一些重要机制的研究提供线索，包括DNA复制、修饰、修复，更重要的还有甲基化以及组蛋白修饰等等；还能帮助我们更好的 理解一些疾病的发生机理比如糖尿病、白血病、乳腺癌等。除此之外，ChIP-on-chip技术也已在一些至关重要的生命过程中为我们提供了重要的线索， 包括细胞增殖、细胞分化、癌症发生、细胞周期、细胞凋亡以及神经生成等过程。 研究基因启动子部位组蛋白的甲基化乙酰化或磷酸化水平改变； 研究基因启动子部位DNA甲基化水平改变 研究转录因子与其结合的所有基因启动子DNA

GeneChip-TilingArray技术简介 Affymetrix公司于2006年1月24日宣布推出GeneChip（R）人类和鼠源嵌合芯片（TilingA，ray）系列产品。该系列芯 片研究范围大大超出已知编码蛋白序列，可以对整个人类和小鼠基因组进行系统的研究 嵌合芯片 （TilingArray）是迄今为止分辨率最高的基因芯片类型，其探针设计几乎涵盖了目标DNA的全部序列。迄今为止，Affymetrix公司已经开 发出了人、小鼠、酵母、线虫、拟南芥等模式生物的全基因组Tiling芯片，为全基因组规模上研究目的蛋白与核酸的相互作用提供了强有力的分析工具。 GeneChip-TilingArray除了全基因组芯片外，还包括了专门应用于ChIP—Chip技术中的人启动子和小鼠启动子两款芯片，探针设计覆 盖了转录起始位点附近10kb的范围，可针对肿瘤相关的1 300个基因，覆盖范围更是增加到了12.5kb。

液态芯片原理 编码微球：分别用不同配比的两种荧光染料将直径5.6μm的聚苯乙烯微球（Beads）染成不同的荧光色，从而获得多达100种经荧光编码的微球。 交联探针、抗体或抗原：把针对不同检测物的核酸探针、抗体或抗原以共价方式结合到特定荧光编码的微球上。 检测反应：先把针对不同检测物的、用不同荧光色编码的微球混合，再加入被检测物（可以是血清中的抗原、抗体或酶等，也可以是PCR产物）。 悬液中的微球与被检测物特异性结合，结合物被标记上荧光物质。