第五章 体内药物分析 体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学 体内药物分析又被称为 第五章 体内药物分析 体内药物分析是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学 体内药物分析又被称为 生物医药分析 Biomedical Analysis 生物药物分析 Biopharmaceutical Analysis

——药物的体内研究和治疗药物监测 ——药物分析的重要分支学科 ——研究生物机体中外源性药物及其代谢物和内源性活性物质的质与量的变化规律 ——综合性较强的应用学科:分析方法学 ——为将来的相关课程（临床药学、临床药理学、生物药剂学）学习和实验研究奠定重要的基础

——经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程 药物进入体内后 ——经过吸收、分布、代谢和排泄等动力学过程 ——化学结构和存在状态都可能发生变化 ——在不同个体中存在差异（个体差异） ——进而直接影响到药物在不同个体中的治疗效应和毒副作用 ——需对生物体内药物及其代谢物进行研究分析

药物在人（或动物）体内的存在形式 游离型:原形药物或代谢物 药物或其代谢物与葡萄糖醛酸等结合:缀合物 药物与蛋白质结合:结合物 体内药物分析的任务 检测人（或动物）的体液或组织（生物样本）中的药物或特定代谢物的浓度

生物样本的特点 1.药物浓度：低，要求方法灵敏度高 2.干扰物质：多，要求方法专属性好 3.样品量少、不能重复取样.生物样品多数在特定条件下采集，无法再次取样，且浓度低、变化幅度大. 在样品测定之前，进行适当的样品制备， 进行分离、纯化、浓集、必要时还需对待测组分进行化学衍生化，然后进行测定

评价药物的安全性（临床前研究）：动物 评价药物的有效性（临床研究）：人体（健康志愿者或患者） 用药的安全、有效与合理：人体（患者TDM :治疗药物血浓度监测 ）

分析方法有: ①色谱法:HPLC,HPCE,GC ②光谱法:比色法、紫外-可见分光光度法、荧光分光光度法、原子吸收分光光度法 ③免疫分析法:放射免疫法RIA、酶免疫法EIA、化学发光酶免疫、荧光免疫分析 ④联用技术:GC-MS、LC-MS、LC-NMR

发展概况 70年代初:体内药物分析在国外开始建立 70年代末:血药浓度监测广泛用于临床 80年代:体内药物分析学科雏形基本形成 20世纪60年代:临床药理学与生物药剂学建立 70年代初:体内药物分析在国外开始建立 70年代末:血药浓度监测广泛用于临床 80年代:体内药物分析学科雏形基本形成 国内发展概况：在70年代末受到关注 1979年有相关论文发表 1981年在“中国药学会药物分析第一次学术会议”大会上作学术报告，引起了广泛的关注和兴趣 80年代中期，许多高等医药院校为本科生、硕士研究生开设了体内药物分析必修和选修课程.

学科主要研究问题 游离型血药浓度测定方法研究 血中游离型药物浓度(F)与总浓度(T)的比率(F/T)及唾液与血液游离浓度的比率(S/P)以及它们之间的相关性的研究 代谢物的监测与研究 对映体的监测与研究 体内微量元素的测定与研究 方便、快捷的样品制备方法与样品直接进样分析的研究 分析新方法、新技术的联用研究 体内药物分析方法的质量控制研究

第一节 常用体内样品的制备与贮藏 一. 样品种类，采集与制备 第一节 常用体内样品的制备与贮藏 一. 样品种类，采集与制备 1.血样：血药浓度一般指血浆（血清中）药物浓度，它可正确反映药物在作用点的浓度。 药物在血中分布均匀后取样：a.动物：动脉或心脏，b.人静脉或毛细管采血. 血液：a.加抗凝剂混合（EDTA,肝素etc),离心(3000r/min ，5min)取上清液为血浆。b.室温放0.5~1h，3000 r/min离心5~10 min ,取上清液为血清。C.全血.

要点：取样后及时分离出血浆（清），随后进行分析，若不能马上测定，应密塞后置冰箱保存（时间短：4℃，长：-20℃) 应用:药物动力学;生物利用度;临床治疗药物监测(TDM)

2·尿液 优点：易收集、量大，主要用于药物剂量回收，尿清除率，生物利用度研究，以及药物代谢研究，一般采集24h尿液，最好立即测定，否则要加防腐剂（PhCH3,CHCl3etc）置冰箱保存。 缺点：尿液中药浓度与血药浓度相关性差，肾功能不全者不适于取样 3·唾液： 优点：样品易得，采集无痛，无危险。 缺点：一般唾液中药浓与血药浓度不吻合，易变

4.组织：用于药物体内动力学研究 步骤：取样，匀浆，去蛋白 5.头发：主要用于体内微量元素的测定。 枕部取样，洗净，消化或者高温灰化后测定

二 体内样品的贮藏与处理 1.冷藏或冷冻 2.去活性：快速冷冻；微波照射；加入酶活性阻断剂或者抗氧剂；高温煮沸。

第二节.体内样品分析的前处理 依据: 1）样品种类（血，尿） 2）被测药物结构及性质 3）测定方法：专属性，LOD 应用： 1.药物含量高，处理简单。 2.样品干扰小,(如尿）,前处理简单 3.测定方法专属性好(HPLC),前处理简单。

一. 目的 1.使待测药物游离 2.满足测定方法的要求:重点考虑分析方法的灵敏度和专属性. 3.改善分析环境:如HPLC.

二.样品前处理方法· 1.去除蛋白质 目的：①使结合型药物释放出来 ②减少乳化 ③保护色谱柱 二.样品前处理方法· 1.去除蛋白质 目的：①使结合型药物释放出来 ②减少乳化 ③保护色谱柱 方法： 1）加入与水相混溶的有机溶剂（EtOH,Me2CO, CH3CN, etc）,混匀后离心，取上清液分析（破坏氢键使蛋白质凝聚）. 2）加中性盐[Na2SO4,(NH4)2SO4 ]：与水结合，使蛋白质脱水而沉淀，离心后取上清液。

3）加强酸（CCl3COOH,HClO4）,适于pH＜PI,蛋白质为阳离子,与强酸形成不溶性盐而沉淀。 4）加锌或铜盐的沉淀剂如CuSO4-Na2WO4, ZnSO4 –NaOH,适于pH＞PI,蛋白质为阴离子，与金属阳离子形成不溶盐而沉淀 5）酶解法：用枯草菌溶素使肽链降解，50~60 ℃具最大活力，条件温和，作用强，适于酸不稳定及结合牢固的药物. 6)热凝固法

目的：消除干扰，使待测物以适合的形式和量用于分析。 样品前处理· 2.分离，纯化，浓集 目的：消除干扰，使待测物以适合的形式和量用于分析。 (1)液-液提取（LLE） ①药物亲脂性强 ②内源性杂质亲水性强 采用有机溶剂提取后可大大纯化样品

1）有机溶剂(极性见表5-1)：要求对待侧组分S大，bp低，水溶性小，无毒，稳定，不易乳化。常用Et2O,CHCl3 2）二相体积比：采用少量多次提取法。 3）水相pH值：主要考虑药物的酸碱性 如：选择水相pH为碱性 游离碱 脂液 成盐 水溶性增加 药物是生物碱 内源性杂质为酸性

（2) 固相萃取（Solid-phase Extraction,SPE） 小型柱色谱，填料粒度小，分离效能高，无乳化现象，处理样品速度快，常用提取： a.亲水性用硅藻土；b.疏水性用C18.由Varian公司生产的半自动样品制备系统（Advanced automated sample processor, AASP)使SPE更简便，快速，样品经10个固定微型柱离线萃取，微柱转移到自动进样器做预柱，由流动相将分析物洗脱至分析柱。 缺点：成本高

(3)超滤:一种膜分离技术,按照分子量大小,分离水溶性生物大分子.

3.缀合物水解 含极性基团（OH,NH2,COOH）的药物，常与内源性物质（如葡萄糖醛酸）形成缀合物，当测定尿液中药物浓度时，需将缀合物中药物释出，常用酸解或酶解的方法。

4.化学衍生 目的： 1）提高检测灵敏度，如HPLC紫外检测 2）增加药物稳定性。 3）提高药物分析能力，如： a.GC中的-COOH衍生成-COOCH3增大挥发 性，减少极性。 b.手性分离中：生成非光学异构体（普通柱色谱分析）

1）GC: R—COOH Ar-OH CH2N2 CH3OH RCOOCH3 RCOOSiMe3 ArOCOCH3 Ar-O-CH3 Ar-OSiMe3

2）手性分离： +（R）-E （R）E-（R）SA （R）E-（S）SA R-SA S-SA 手性药物 光活性试剂 非对映异构体

3）HPLC:如庆大霉素C组分检查 a.柱前衍生 b.柱后衍生，需一个额外的泵

第三节 定量分析方法验证· 一 分析方法的建立 1.分析方法:色谱分析法;免疫分析法;生物学方法. 2.步骤:(1)色谱条件选择,(2)色谱条件优化:空白溶剂试验→考查溶剂影响;空白生物基质试验→考查生物基质中内源性物质的影响(方法特异性); 质控生物样品试验（空白生物基质中加入待测药物）→考查方法效能指标;(3)实际样品(Incurre samples)测试→代谢产物的干扰(方法特异性)

二 分析方法验证(validation) 用于实际生物样品分析之前验证分析方法的可行性与可靠性

（一）方法特异性specificity (专属性或选择性selectivity) 系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力 专属性：表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的能力。 选择性：系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力。 特异性：函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性。

比较对照品（或标准品），空白生物基质，模拟生物样品（空白生物基中加对照品）信号。 1. 内源性物质的干扰 考查待测药物或其活性代谢产物检测信号 比较对照品（或标准品），空白生物基质，模拟生物样品（空白生物基中加对照品）信号。 如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致， 及与内源性物质色谱峰的R 确证：内源性物质对分析方法有无干扰

2. 代谢产物的干扰 确证：其它代谢产物对分析方法有无干扰 结构已知的特定活性代谢物的测定 比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号与代谢产物的R值。 确证：其它代谢产物对分析方法有无干扰 结构已知的特定活性代谢物的测定 必要时通过HPLC-DAD或LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性 对于结构未知的代谢产物的测定，可采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况。

3. 伍用药物的干扰 比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 确证：同时服用药物对分析方法的干扰情况 进行TDM时，还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限)的干扰。 比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 确证：同时服用药物对分析方法的干扰情况

4. 与参比方法的相关性 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法 如在TDM中使用UV(或RIA)时, 可以用HPLC(或GC)为参比；以参比方法测定结果为横坐标(X); 拟定方法测定结果为纵坐标(Y) 用最小二乘法计算回归方程 Y＝a＋bX (坐标标度相等)和相关系数(r)——表示两种方法测得结果的一致性。

截距(a)：表示拟定方法受到恒定干扰的程度：内源性物质(UV) Y＝a＋bX 截距(a)：表示拟定方法受到恒定干扰的程度：内源性物质(UV) 斜率(b)：表示拟定方法受到比例干扰的程度：标记抗原不纯(RIA) 与参比方法的相关性比较:除显示分析方法的特异性外,斜率b表示两种方法测得结果的一致性 若截距a≈0, 则拟定方法的准确度(回收率)为100b(%)

（二）标准曲线和定量范围 标准曲线(standard curve)，or叫校正曲线(calibration curve)，or working curve 生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性 通常用回归分析方法所得的回归方程来评价 除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式 回归分析法为最小二乘法（least squares） 或加权最小二乘法（weighted least squares 1·使用与待测样品相同的生物介质。 2·标准曲线点数≥6，线性范围包含全部待测浓度。

3.标准曲线的高低浓度范围叫定量（线性）范围（quantification range），应能覆盖全部生物样品中的药物浓度 4.以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高) 或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量,y)对标准样品中药物浓度(自变量,x)，进行线性回归，求得回归方程(y＝a＋bx)及其相关系数(  )，最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%～5%，并应为方法的LOQ，回归方程的截距应接近于零，相关系数要求 ≥0.99(色谱法)或≥0.98(生物学方法)

5.标准系列模拟生物样品的制备 ①先加入标准溶液 ②再加入空白生物基质 ③涡旋混匀 空白生物基质(如血浆)——加入标准系列溶液适量，涡旋混匀，防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成损失 ①先加入标准溶液 ②再加入空白生物基质 ③涡旋混匀 　　　　　　

标准曲线上的最低浓度点，表示方法的灵敏度（sensitivity），即测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。 （三）定量下限（LLOQ） 标准曲线上的最低浓度点，表示方法的灵敏度（sensitivity），即测定样品中符合准确度和精密度要求的最低药物浓度。 应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度 准确度在80%～120%(或RE在±20%的范围内) RSD应＜20%

（四）精密度precision与准确度accuracy 高中低三个浓度的QC样品，LOQ附近，标准曲线上限及中间各一个浓度各5个样。 日内，日间精密度的RSD＜15%，LOQ附近20%，加样回收率85~115%,LOQ附近80~120%。

限度要求:相对回收率应在85%～115% (LOQ附近80%～120%),RE在±15% (LOQ附近为±20%) 准确度以测定值M (measured)的平均值与理论浓度(加入值)A(added)的比值表示 相对回收率 相对误差 限度要求:相对回收率应在85%～115% (LOQ附近80%～120%),RE在±15% (LOQ附近为±20%)

包括批内(within-run或intra-assay)RSD(日内) 方法精密度一般用标准偏差(standard deviation， SD)或相对标准偏差(relative standard deviation， RSD)表示 SD= RSD= = 包括批内(within-run或intra-assay)RSD(日内) 和批间(between-run或inter-assay)RSD(日间)

方差分析法 批间RSD = 批内RSD = =

SSe：批内方差；SSA：批间方差；SStot：总方差；Xij：第i批第j次测定；Xi SSe：批内方差；SSA：批间方差；SStot：总方差；Xij：第i批第j次测定；Xi.:第i批n次测定平均值; X:N次测定总平均值;I:测定批数;n:每批测定次数;N:总测定次数

(五）样品稳定性 室温及冷冻下，测A（吸收度或峰面积）以考察不同条件下，样品的可保存时间及稳定性 QC样品穿插于实际样品测定全过程 模拟(或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察 要求：准确度85%～115%(RE在±15%范围内)，RSD＜15%

（六）提取回收率（extraction recovery） 考察样品处理过程的回收率 重现性好 提取回收率一般应≥50% 高、中浓度的RSD应≤15% 低浓度的RSD应≤20%。

另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用空白生物介质稀释至同体积，同法测定 取空白生物基质(如血浆)，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次 另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用空白生物介质稀释至同体积，同法测定 AT：经提取后的QC样品的检测信号或比值(内标法) AS：未经提取的标准溶液的检测信号或比值(内标法)

（七）质量控制 整个分析过程要遵从预先制定的实验室操作规范（Standard Operating Procedures,SOP)以及GLP原则。

1.标准物质（reference standard）：用于制备标准样品和QC样品。 （八）实际样品浓度超出定量范围的处理 （九）名词解释 1.标准物质（reference standard）：用于制备标准样品和QC样品。 2.生物介质（biological matrix） 3.介质效应（matrix effect） 4.标准样品（standard sample）：用于建立标准曲线。 5.质控样品（quality control sample）：用于监测和评价分析方法的效能和结果的可靠性。

6.质控样品池（pool of QC sample） 7.未知样品（unknown sample）：待分析对象。 8.制备样品（processed sample）：处理好待测定的样品 9.分析批（analytical run/batch):包括未知样品，标准样品和QC样品的完整系列。

小结 1.生物样品的种类. 2.分析样品的采集和前处理方法. 3.分析方法的验证.