模块九 植物遗传转化技术

知识点3 转基因植株的检测 进行基因转化后，外源基因是否整合到植物基因组上并得到有效是我们要回答的问题。因为只有整合有外源基因的植株我们才能认为是转基因植株，得到有效的表达的植株才能可能在生产上应用。

1.外源目的基因PCR鉴定 利用PCR测定导入作物植株基因的特 定DNA序列是否存在。PCR可对插入两个 已知DNA序列之间的特定DNA序列进行特 别和灵敏的扩增。通常，导入的基因结 构（基因卡盒）由3部分构成：启动子、 结构基因、终止子。

PCR扩增反应体系 常规PCR检测用引物 反应成分 终浓度 所需体积 10×Buffer 1ⅹ 1.5ul 25mM MgCl2 1.5mM 5uM PrimerⅠ 0.2uM 0.6ul 5uM PrimerⅡ 10mM dNTP 0.2mM 0.3ul 5U/ulTaq 酶 1.25U 0.25ul 25ng/ul DNA 20-40ng 2ul ddH2O to  Total 15ul 常规PCR检测用引物 检测基因 引物序列(5'-3') 产物(bp) CaMV35S 正TCATCCCTTACGTCAGTGGAG 反CCATCATTGCGATAAAGGAAA 165 NOS 正GAATCCTGTTGCCGGTCTTG 反T T ATCCTAGTTTGCGCGCTA 180 Lectin 正GCCCTCTACTCCACCCCCATCC 反GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG 1l8 ZEIN 正TGAACCCATCCATGCAGT 反GGCAAGACCATTGGTGA L73   Bt 正CAGAGCTCCTATGTTCTCTTGGAT 反AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG 521

2.外源基因转录的RT-PCR检测 反转录酶 AAAn3’ mRNA Olig(dT)n Taq DNA聚合酶 双链cDNA 第一链cDNA mRNA RT-PCR即反转录PCR（reverse transcription PCR ）是先将RNA 转录成cDNA，接着以cDNA为模板进 行PCR扩增的技术。 由于RT-PCR的敏感性，应用 PCR定量法可研究低表达活性基因的 mRNA生理变化动态。 反转录PCR

3.实时荧光定量PCR（real time fluorescence quantitative PCR）测定法： 实时荧光定量PCR是在PCR 反应体系中加入荧光基团，利 用对荧光信号积累的实时检测 来监测整个PCR进程，最后通 过标准曲线对未知模板进行定 量分析的方法。

实时定量PCR仪

几种外源基因实时荧光定量PCR用引物和探针 检测基因 引物序列(5'-3') 产物(bp) NPTⅡ 正AGGATCTCGTCGTGACCCAT 反GCACGGAAGCGGTCA FAM-CGCCCAGCCGGCCACAGTCGAT-TAMRA 183 BAR 正ACAAGCACGGTCAACTTCC 反ACTCGGCCGTCCAGTCGTA FAM-CCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAG-TAMRA 175 NOS 正ATCGTTCAAACATTTGGCA 反ATTGCGGGACTCTAATCATA FAM-CATCGCAAGACCGGCAACAGG- TAMRA 165 CaMV35S 正CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG 反TCTTGCGAAGGATAGTGGGATT FAM-TCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCA-TAMRA 80

4.外源基因核苷酸序列分析 随着人类基因组计划的完成，DNA 序列分析技术逐渐完善，这位转基因作 物的检测提供了一个新的方法。

Sanger 双脱氧末端终止法原理

DNA自动测序仪 自动荧光垂直板凝胶电泳测序仪 代表：ABI公司377型垂直板自动测序仪 96个泳道 读长高达700-800 bp 日分析能力达300个样品                                                                                                                                                   电泳，看谁跑得快 荧光检测探头 自动荧光毛细管凝胶电泳测序仪 代表：安玛西亚公司 MegaBACE1000 96个电泳 读长高达500-600 bp 日分析能力达1000个样品 短片段先检测到 长片段后检测到

4.核酸分子杂交检测法 若退火的核酸来自不同的生 物有机体，则称形成的双链分子 就叫做杂合分子，此过程称为分 子杂交。 双链DNA或具有二级结构的RNA 变性后，具有互补序列的两条单 链的退火复性过程 若退火的核酸来自不同的生 物有机体，则称形成的双链分子 就叫做杂合分子，此过程称为分 子杂交。

在分子杂交时，若其中的一条链被人为标记上， 该标记可以通过某种特定方法检出，即成为所谓 的探针。探针与其互补的核育酸序列杂交后，杂 交体也就带上了同样标记，可检测出来。 这样，以特定的已知核酸序列做探针，就可以在 诸多的核酸序列中，通过杂交探测出与其互补的 序列，因而分子杂交是进行核酸序列分析，重组 子鉴定以及检测外源基因整合及表达的强有力的 手段。

4.1 DNA印迹杂交(Southern blotting) 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的基因组DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。 此方法是在基因组水平对转基因植株进行的检测

DNA印迹杂交一般步骤 探针 (probe)为带有标记的外源基因或或其同源的RNA或寡核苷酸序列。

4.2 RNA印迹杂交(Northern blotting) 将变性琼脂糖胶电泳分离的RNA或mRNA，转移吸 印到特殊活性滤膜或滤纸上，与标记的探针杂交，然 后放射自显影以分析RNA（大小、数量）的方法，叫 做RNA吸印杂交技术 此方法是在转录水平对转基因植株进行的检测

5.外源基因表达蛋白的鉴定 此方法是在表达水平对转基因 植株进行的检测 外源基因编码蛋白在转基因植 物中能够正常表达并表现出应有的 功能是植物基因转化的最终目的。 此方法是在表达水平对转基因 植株进行的检测

5.1酶联免疫吸附(ELISA)法 酶联免疫吸附法 (Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays,ELISA) 基本原理是酶分子与抗体或 抗抗体分子共价结合，此种结合 不会改变抗体的免疫学特性，也 不影响酶的生物学活性。

酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生 特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含 的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。 因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应， 颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。 此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就 将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来， 使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

5.2蛋白质印迹杂交法(Western Blotting ) 与Southern Blot或 Northern Blot杂交方法 类似，但Western Blot法 采用的是聚丙烯酰胺凝胶 电泳，被检测物是蛋白质， “探针”是抗体，“显色” 用标记的二抗。

经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品， 转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及 其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗 原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第 二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分 离的特异性目的基因表达的蛋白成分。