基于酶联技术的分子检测 add your subheading 主讲人：孙洁 Shandong University

HIV试纸检测 血液检测步骤

HIV试纸检测 快速检测试验：可采集全血或毛细血管的血液，一般15-30分钟可出结果。但假阳性及假阴性率均较高，不作为常规检测 HIV抗体初筛实验---ELISA

1 2 3 4 5 Contents 酶联免疫法--ELISA 基本原理 用于标记的酶 抗体的酶标记方法及标记效果测定

酶联免疫法 简称ELISA，其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 ( 聚苯乙烯微量反应板 ) 表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。常用的 ELISA 法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。 自从Engvall和Perlman（1971）首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。 尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。

基本原理 酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。此种酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，出现颜色反应。因此，可通过底物的颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。此种显色反应可通过ELISA检测仪进行定量测定，这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。

基本原理

用于标记的酶 高度的活性和敏感性 在室温下稳定 用于标记 的酶需具有 的特性 反应产物易于显现 能商品化生产

用于标记的酶 目前应用较多的有： 辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶

Horseradish peroxidase（HRP） HRP同工酶C二级结构 308个aa组成的肽链 含有血红素，能利用H2O2氧化许多有机物和无机物 N端：固定的吡咯烷酮羧基 C端：经常丢失的丝氨酸 4个由两分子半胱氨酸组成的二硫键 HRP同工酶C三级结构 α螺旋 Β折叠

标记方法 郭春祥改良 HRP标记抗体的改良过碘酸纳法 简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备 戊二醛法 过碘酸盐氧化法。 酶与抗体交联，常用： 戊二醛法 过碘酸盐氧化法。 良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白，最好使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。

具体操作： 将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。

标记方法

酶标抗体标记效果测定 （1）酶与抗体的活性 （2）结合物的定量测定 常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。 （2）结合物的定量测定 　一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定。 酶结合率为 7％时效果一般，为9％－10％较好，达30％以上时最好。

ELISA方法的步骤及基本类型 ELISA的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 step1 step2 step3 稀释酶复合物加血清、 阴阳性对照 、质控品 孵育一小时 洗板 加底物 避光反应半小时 加终止液 读数 判断阴性或阳性 血液凝集取血清 ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清（这是有些网友不理解为什么医院抽完了血对血置之不理的原因，其实是误会）。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。 　　

ELISA方法的步骤

ELISA方法的步骤

ELISA具体方法： （1）双抗体夹心法 （2）双位点一步法 （3）间接法测抗体 （4）竞争法 （5）捕获法测lgM抗体 （6）应用亲和素和生物素

竞争法 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：  　　（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。 　　（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。 竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。

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