原癌基因Pim-3在胰腺癌发生中的作用机制以及分子靶向治疗药物的开发 李 影奕 复旦大学附属肿瘤医院实验研究中心 复旦大学上海医学院肿瘤学系

报告内容 Pim-3激酶在胰腺癌发生中的作用机制 以Pim-3为靶向治疗分子的新型有效的 抗肿瘤药物的开发

Pim-3激酶在胰腺癌发生中的作用机制

研究背景 Pim基因敲出的小鼠生命力旺盛且可繁殖后代 Pim-3是原癌基因。 Pim-3 与恶性转化相关 Pim-1 Pim-2 Pim-3 Kinase Domain Deneen B. et al. Mol Cell Biol 2003;23:3897 Mikkers H. et al. Mol Cell Biol 2004;24:6104

Pim-3激酶是否与肝脏以外的其它脏器肿瘤发生有关？ 我们聚焦在同是内胚层来源的器官，胰腺。 Pim-3 is a proto-oncogene with serine/threonine kinase activity. Fujii C et al. Int J Cancer. 2005 Mar 20;114(2):209-18. Pim-3激酶是否与肝脏以外的其它脏器肿瘤发生有关？ 我们聚焦在同是内胚层来源的器官，胰腺。

Pim-3 蛋白在人胰腺癌组织和胰腺癌细胞株中高表达 Normal Tissue Cancer Tissues PCI55 PCI35

Pim-3 siRNA 干扰Pim-3蛋白表达，导致人胰腺癌细胞株细胞凋亡，从而降低细胞活力 No-shRNA Scramble shRNA Pim3 shRNA 8 7 6 5 4 3 2 1 0 shRNA kDa Non Scramble Pim-3 Pim-3 * * 36 Cell viability ratio * Actin * 43 WCL 0 1 2 3 4 5 Time after passage (days) No shRNA Scramble shRNA Pim-3 shRNA Scramble shRNA Scramble shRNA Pim-3 shRNA Pim-3 shRNA SubG1 Annexin V DNA Content PCI55

Pim-1 and Pim-2 Can Inactiavte Pro-apoptotic Molecule, Bad, by Phosphorylating Its Serine Residues ＋ Survival Factor Pim-3 ? PI3K Pim-1, Pim-2 AKT 14-3-3 Bcl-XL Ser112 Ser136 + Bad Bad Bad Bcl-XL Apoptosis Survival

Pim-3 和 Bad 的相互作用 Pim-3 Bad Pim-3/Bad PCI55 IP: a-Bad a-Pim3 a-IgG 20mm PCI55 IP: a-Bad a-Pim3 a-IgG Immunoprecipitation with anti-Pim-3 HeLa kDa PCI35 PCI55 PCI55 25 IgG Western blotting with anti-Bad 26 Bad Blot: anti-Bad Washing with Stripping buffer 50 IgG Western blotting with anti-Pim-3 36 Pim-3 Blot: anti-Pim3

Pim-3和磷酸化Bad在细胞质内共定位 Pim-3 pBad112 Pim-3/pBad112 PCI35 PCI55 20mm

降低Pim-3 蛋白表达可以减少 Bad112磷酸化 shRNA Non Scramble Pim-3 KDa 36 Pim-3 26 pBad112 26 pBad136 26 pBad155 26 Bad 43 Actin PCI55

Pim-3 对于难治性胰腺癌来说是一个很好的靶向治疗分子 小结（1） Pim-3 对于难治性胰腺癌来说是一个很好的靶向治疗分子

以Pim-3为靶向治疗分子的新型有效的抗肿瘤药物开发

研究背景 Pim-3作为药物靶点，特异性更强。 胰腺癌是我国十大恶性肿瘤之一 〉早期诊断困难 〉晚期患者手术治疗5年生存率低于5%，发病率等于死亡率 传统的化学治疗存在抗肿瘤能力低，杀伤指数过小，副作用大等缺点 分子靶向治疗具有特异性强，效果显著，正常组织损伤小等优点 现有的抑制增殖因子受体活性的分子靶向治疗缺乏肿瘤治疗的特异性，而且容易产生耐药性 Pim-3作为药物靶点，特异性更强。

低分子化合物的筛选 蔓生百部碱是百部属生物碱中的一种，其在中国和日本民间医学中作为镇咳药。 Pim-3与Pim-1具有高度的同源性（70%）和类似的生物功能 推测Pim-3的立体空间结构 低分子化合物-Pim-3激酶复合物立体空间结构 从DrugBank和PubChem数据库中筛选了23种类似低分子化合物 选择并合成了对Pim-3有高亲和性的小分子化合物-蔓生百部碱（stemonamide）合成中间体 蔓生百部碱是百部属生物碱中的一种，其在中国和日本民间医学中作为镇咳药。

蔓生百部碱合成中间体结构 合成顺序：T-10 >T-6, T-10 >T-4 >T-5, T-10 >T-2 >T-3

Pim-3 T2, T5体外抑制Pim激酶活性 Pim-1 Pim-2

T-2和T-5抑制Pim激酶活性，却不抑制AKT/PKB的活性 IC50 (mmol/L) Pim-3 Pim-1 Pim-2 AKT-1 AKT-2 T2 T5 T10 AKT1/2 78 92 >2000 nd 90 56 >2000 nd 33 50 >2000 nd 1934 > 2000 345 462 > 2000 > 2000 31.58 72.47

T-2， T-5体外抑制人胰腺癌细胞株的细胞增殖 L3.6pl Miapaca-2 Cell proliferation ratio Times after treatment with inhibitor (days)

L3.6pl 6.6 26.1 MiaPaca-2 5.9 22.9 IC50 (mmol/L) Cell line name T-2 T-5 L3.6pl 6.6 26.1 MiaPaca-2 5.9 22.9

过表达Pim-3可以部分逆转由T-2引起的细胞活力下降 Relative OD450 MiaPaca-2

T-2 引起人胰腺癌细胞产生细胞凋亡

T-2抑制Pim-3激酶活性，阻止pBad112, 减少Bcl-XL的表达， 依赖细胞色素C和Caspase-3途径导致细胞凋亡。 -DMSO T-2 +12 h +48 h +24 h pBad112 pBad136 pBad155 Bad Bcl-XL PIM-3 Cytochrome C Caspase-3 Cleaved-caspase-3 Cdc25A Actin L3.6pl

Subcutaneous injection 15days 15 16 17 18 19 22 23 24 25 26 29 30 31 32 33 36 (days) ↓: Intraperitoneal injection 5X105 L3.6pl Subcutaneous injection T-2 (20mg/kg) Sacrify

T-2引起裸鼠皮下胰腺肿瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖

T-2 抑制肿瘤新生血管形成 **

T-2 对裸鼠血清中的一些生化指标没有影响 Na (mEq/l) 144 148 152 DMSO T2 156 160 20 DMSO NS 20 DMSO T2 5 10 15 ALT (U/l) NS DMSO (N=5) T2 (N=5) DMSO T2 Cl (mEq/l) 108 112 116 120 NS 2 4 6 8 DMSO T2 K(mEq/l) 10 NS

T-2抑制荷瘤小鼠全血中白细胞的数量增多， 使其恢复到正常 Hematological parameters DMSO T2 (n=5) (n=6) RBC Platelets WBC Neutrophil Eosinophils Basophil Lymphocytes Monocytes 〔×106/ml〕 〔×104/ml〕 〔×103/ml〕 〔%〕 9.3±0.07 8.08±0.33 49.88±3.06 46.72±1.90 30.04±3.84 9.9±1.70＊ 84.2±1.90 81.17±1.10 0±0 　 0.17±0.07 0±0 　 0±0 13.40±1.83 16.67±1.00 2.40±0.46 2.00±0.15 BALB/C裸鼠全血中白细胞正常值 3.84±1.64 〔×103/ml 〕

蔓生百部碱可以作为设计Pim-3激酶抑制剂的先导化合物 开发新药，应用临床，为难治性胰腺癌提供新的治疗方法 小结（2） 线粒体 蔓生百部碱可以作为设计Pim-3激酶抑制剂的先导化合物 开发新药，应用临床，为难治性胰腺癌提供新的治疗方法

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