免疫细胞的分离与功能测定

一 外周血单个核细胞的分离 原理: 密度梯度离心， 利用密度为1.077±0.001g/L 淋巴细胞分层液（聚蔗糖-泛影葡胺）

主要步骤 1 无菌采集静脉血，抗凝（每1ml全血加0.1ml 125～250U /ml 肝素溶液） 2 用等体积Hanks平衡盐溶液(HBSS)或pH7.2～7.4 PBS 稀释 3 按每10ml稀释血用3～5ml淋巴细胞分层液的比例先将淋巴细胞分层液加入离心管中，再小心沿管壁缓慢加入稀释血，注意切勿使血液混入分层液 4 2000r/min 水平离心30min， 5 吸取分层液与血浆交界部位的单个核细胞，用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次依次以2000 r/min，1500 r/min离心10min 6 用完全RPMI-1640定容，计数。一般每ml健康成人血可分离出1×106～2×106单个核细胞 7 台盼蓝染色，检查细胞活性，活细胞应﹥95﹪。

注意事项 1 严格无菌操作 2 操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀 3 淋巴细胞分层液应4℃避光保存，取出后待温度升至室温使用 4 如须保存血浆作他用，则不能稀释血液 5 离心最适温度18～20℃ 6 分离组织中的单个核细胞也可采用上法

二 淋巴细胞的纯化 ㈠红细胞的去除 1 低渗裂解法 1ml蒸溜水加入沉淀的PBMC中，轻摇（﹤1min） 立即加入1.8﹪NaCl, 洗涤 2 氯化铵处理法 沉淀的PBMC中加入1ml 0.83﹪氯化铵溶液，轻摇2 min，洗涤

㈡血小板的去除 1 .PBMC经洗涤2～3次可去除大部分血小板 2 .胎牛血清(FCS)梯度离心 1ml PBMC悬液（1×107～2×107/ml）用3ml FCS 800r/min 水平离心15min，18～20℃

㈢单核细胞的去除 1 .粘附去除法

原理 单核细胞可粘附在玻璃或塑料表面 ⑴PBMC用完全RPMI-1640调整浓度至2×106/ml ⑵将50ml细胞悬液移入150cm2培养瓶，37℃ 5﹪CO2 95﹪湿度培养1h ⑶收集非粘附细胞，再用预温至37℃的RPMI-1640 ,轻轻荡洗培养瓶并收集荡洗液 ⑷1300r/min 离心10 min，18～20℃ ⑸弃上清，用5～10ml完全RPMI-1640悬浮细胞计数，用台盼蓝染色检查细胞活性

2. L-亮氨酸甲酯去除法 溶酶体酶→L-亮氨酸甲酯 →L-亮氨酸-L-亮氨酸甲酯 此法也可清楚NK细胞和细胞毒性T细胞 本法只适用于分离新鲜细胞

⑴用PBS调整细胞浓度至3×1065×106/ml，用无血清RPMI-1640配制10mmol/L的L-亮氨酸甲酯溶液（临用时配），两液按1︰1比例混合，室温40min ⑵1300r/min 离心10 min，用HBSS或PBS洗涤沉淀共3次 ⑶用完全RPMI-1640悬浮细胞，用无菌尼龙网过滤，离心并计数，调整细胞至所需浓度

3. 羰基铁吞噬离心法

在抗凝血中加入一定量羰基铁粉，37℃搅拌15 min，然后用淋巴细胞分层液离心分离 亦可先分离PBMC，再加羰基铁粉分离去除单核细胞 粘附法去除单核细胞后，大约95﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪ L-亮氨酸甲酯法，99﹪为淋巴细胞，活性＞95﹪

三 外周血淋巴细胞选择性分离 ㈠ T细胞的分离 1 .尼龙棉柱法 原理 B细胞易粘附于尼龙棉纤维，而T细胞则否

尼龙棉（聚酰胺纤维）预处理 尼龙棉（聚酰胺纤维）50mg在0.2mol/L HCl浸泡过夜，用大量蒸溜水漂洗，晾干。 尼龙棉柱制备 塑料软管 长12～16cm 内经5～6mm 壁厚0.2 mm高6cm的尼龙棉柱可有效地滤过20×106～30×106个细胞.此法分离的T细胞纯度可达90﹪以上

2 .花环形成分离法 原理 T细胞表面有绵羊红细胞受体，可与绵羊红细 胞结合形成花环. 绵羊红细胞用2-氨基乙基异硫脲溴化物（AET）或神经氨酸酶（NM）可提高花环形成的效果和稳定性

⑴1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和 1ml 4﹪AET-SRBC悬液混匀，37℃水浴10 min ↓ 800r/min 4℃离心5 min，冰浴1h 或 800r/min 室温离心10 min，4℃2h 置淋巴细胞分层液（3～5ml分层液可分离10mlPBMC/NCS/AET-SRBC混合液） 1300r/min 离心25 min，18～20℃ 或 2000r/min 离心35 min，4℃ 位于界面的是非花环形成细胞，沉淀的是花环形成细胞

⑵1ml PBMC悬液(1×107/ml)、2ml NCS和 2ml 2﹪NM-SRBC悬液混匀，37℃水浴10 min 以下步骤同⑴ 经1次花环形成试验所得到的花环形成细胞中，T细胞﹥95﹪，B细胞﹤1﹪，单核细胞约为2﹪。经2次花环形成试验后，非花环形成细胞中T细胞﹤2﹪ 用此法时，因SRBC与受体结合可激活某些T细胞，导致功能增强

㈡ T细胞亚群的分离 1. 间接免疫吸附分离法 原理 T细胞 + 抗某种T细胞分化抗原的抗体 ↓ 加入包被有羊抗鼠Ig的平皿

2 .抗体/补体介导的细胞毒作用分离法 原理 是一种负性分离法 T细胞 + 抗某种需去除T细胞分化抗原的抗体+补体→该亚群T细胞裂解 如 T细胞 + 抗CD4抗体 + 补体→CD4+细胞裂解 T细胞 + 抗CD8抗体 + 补体→CD8+细胞裂解

3.免疫磁性微珠分离法 原理 羊抗鼠Ig + 磁性微珠→免疫磁性微珠 T细胞 + 抗某种亚群分化抗原的抗体 ↓ 加免疫磁性微珠 在外加磁场作用下，该亚群T细胞连同免疫磁性微珠一起沉降

如 T细胞 + 抗CD4抗体 ↓ 加免疫磁性微珠 在外加磁场作用下，CD4+T细胞连同免疫磁性微珠一起沉降，CD8+T细胞则留在悬液中 优点 细胞纯度高，产量大，操作简单

㈢ B细胞的分离 1 .负性B细胞分离法 ⑴用密度梯度离心法分离PBMC ⑵用L-亮氨酸甲酯法去除单核细胞、NK细胞、细胞毒性T细胞 ⑶用花环形成法去除T细胞 用此法分离B细胞，240ml 全血中可得1×107～2×107个B细胞，纯度﹥90﹪，2﹪～3﹪的单核细胞，﹤1﹪的其他细胞

2 .直接免疫吸附法 兔抗人Ig包被平皿 ↓ 淋巴细胞悬液 洗去未吸附细胞，收集吸附细胞

3.间接免疫吸附法 淋巴细胞悬液 + 抗CD19、抗CD20抗体 ↓ 羊抗鼠Ig包被的平皿 洗去未吸附细胞，收集吸附细胞 4.免疫磁性微珠分离法

㈣ NK细胞的分离 1.负性NK细胞分离法 ⑴用密度梯度离心法分离PBMC ⑵用粘附法去除单核细胞 ⑶用尼龙棉柱法去除B细胞 ⑷用花环形成法去除T细胞 2 .免疫磁性微珠分离法，抗CD16抗体

四 淋巴细胞亚群的检测 ㈠ 免疫荧光技术 直接法 FITC-抗CD4抗体 FITC-抗CD8抗体 间接法 FITC-羊抗鼠Ig 抗CD4抗体

㈡ 微量细胞毒试验 PBMC + 抗某亚群T细胞分化抗原的抗体+补体 ↓ 加染料，该某亚群T细胞着色 如 T细胞 +抗CD4抗体+补体 加伊红染料，呈红色的为CD4+细胞

㈢花环技术 1葡萄球菌花环法 原理 SPA可与IgGFc段结合 直接SPA菌花环法 SPA菌-抗CD3、SPA菌-抗CD4、SPA菌-抗CD8 间接SPA菌花环法 SPA菌-兔抗鼠Ig（IgG类） 抗CD3、抗CD4、抗CD8

2 红细胞花环法 原理 将SRBC与mAb或兔抗鼠IgG偶联 直接红细胞花环法 SRBC-抗CD3、SRBC-抗CD4、SRBC-抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率

间接红细胞花环法 抗CD3、抗CD4、抗CD8分别与去除粘附细胞的PBMC作用，加入SRBC-兔抗鼠IgG偶联物作用，染色后镜检200个淋巴细胞，计算花环形成细胞百分率

五 淋巴细胞功能测定 ㈠ 淋巴细胞增殖试验 非特异性刺激物 PHA、ConA、PWM、SPA、LPS，胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白质，抗CD2、抗CD3、抗IgM等细胞表面标志的抗体，及某些细胞因子 特异性刺激物 特异性抗原

1 .丝裂原刺激的淋巴细胞增殖试验 丝裂原→淋巴细胞→淋巴母细胞 ⑴ 3H-TdR掺入试验 SI﹦试验组cpm/对照组cpm

⑵ 形态学方法 结果以淋巴细胞转化率表示 ⑶ MTT比色法 琥珀酸脱氢酶→MTT→甲月赞+盐酸异丙醇或二甲基亚砜→溶解后测OD值 SI﹦试验组OD均值/对照组OD均值

2 .混合淋巴细胞培养 单向混合淋巴细胞培养 双向混合淋巴细胞培养 可分3H-TdR掺入法、形态学方法及MTT比色法

3 .自身混合淋巴细胞反应 4 .淋巴因子诱导的细胞增殖反应 如 IL-4→B细胞，IL-2→T细胞

5 .影响细胞增殖反应的因素 ⑴细胞应保持高活性， ⑵可溶性抗原刺激淋巴细胞增殖时，常需一定数量的抗原呈递细胞 ⑶不同的刺激原有不同的刺激剂量 ⑷严格无菌操作

六 NK细胞活性测定 靶细胞 人NK细胞 K562细胞（靶细胞） 鼠NK细胞 YAC-1细胞（靶细胞）

㈠ 形态学方法 原理 靶细胞被NK细胞杀伤后细胞膜通透性改变而使台盼蓝染料透入细胞，细胞呈蓝色，无折光性

靶细胞 K562细胞或YAC-1细胞用完全RPMI-1640 调整细胞浓度为2×105/ml 效应细胞 人PBMC或小鼠脾细胞用含15﹪NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为1×107/ml 对照孔 100ul靶细胞＋100ul完全RPMI-1640 实验孔 100ul靶细胞＋100ul效应细胞 效/靶细胞比例（E/T ）为50︰1 各设3个平行空，37℃ 5﹪CO2温箱培养过夜 每孔各取30ul细胞悬液，加30ul 0.5﹪台盼蓝室 温染色5min

于白细胞计数板中每孔各计数100个细胞，记录死 细胞及活细胞数，求出各组NK细胞活性的均值 实验组靶细胞死亡数－对照组靶细胞死亡数 NK细胞活性%﹦ 100 100﹪ ×

㈡ 同位素释放法 1 . 51Cr释放试验 2. 125I-UdR释放试验 3. 全血NK细胞活性同位素检测法

七 单核-巨噬细胞的分离与功能测定 ㈠人单核细胞的分离方法 单核细胞占外周血白细胞的3﹪～5﹪

1 Peroll离心沉淀法 Peroll（聚乙烯吡咯酮包被的硅胶混悬液） Peroll连续密度梯度液配制 Peroll 7ml 和2×PBS 6ml→1500r/min 离心40min 操作步骤 PBMC加到3～5mlNCS上 ↓ 800r/min，离心15 min（18～20℃） 沉淀细胞用含10﹪NCS的PBS配制成2×107～5×107/ml悬液 加到Peroll连续密度梯度液，4℃ 2400 r/min 离心20 min 出现4个细胞层，吸取第二层细胞（单核细胞占70﹪～90﹪），洗涤后计数，配制成所需浓度

2 粘附法 用EDTA抗凝血制备PBMC，用DEME液将PBMC配制成2×106/ml悬液，加入培养瓶（75cm2瓶加10 ml细胞悬液） ↓ 37℃ 5﹪CO2 温箱 1h 用DEME液洗涤2次，洗去非粘附细胞 用细胞刮片刮下细胞，或加入0.2﹪EDTA/PBS， 10min 后收集细胞， 1500 r/min 离心10 min, 配制细胞悬液，计数并调整至所需浓度

3 Colotta法 用PBS5倍稀释的肝素抗凝血20ml，加在20ml淋巴细胞分层液上 ↓ 2000 r/min 离心20 min 室温,吸取PBMC用PBS洗涤两次，500 r/min 离心10 min 弃上清，沉淀中加入5ml含10﹪NCS，25mmol/L HEPES的RPMI-1640培养液 加在5ml 46﹪Percoll液中 2200 r/min 离心30 min 室温，得到3个带，第一 带为富含单核细胞层（83﹪），第二带含少量单核细胞，第三带为淋巴细胞 吸出，洗涤，计数并调整至所需浓度

㈡ 单核-巨噬细胞功能测定 1 单核-巨噬细胞趋化试验 2 巨噬细胞吞噬功能测定

⑴人体巨噬细胞的获取 ①用1cm2大小滤纸蘸满10﹪斑蝥酊置于前臂皮肤 ②4～5h后可见局部皮肤发红 ③48h后局部形成水疱 ④无菌吸取水疱液,一般可吸1～2ml,最多可吸8ml, 巨噬细胞平均为30﹪～40﹪,最多可达80﹪ ⑵ 鸡红细胞悬液制备 阿氏液抗凝鸡血,洗涤3次后配成5﹪CRBC悬液

⑶吞噬试验 皮泡液0.5ml＋5﹪CRBC悬液0.01ml ↓ 37℃水浴30min,每10min轻摇1次 1000r/min 离心5min, 细胞用甲醇固定,Giemsa染色 油镜观察100～200个巨噬细胞,计算吞噬率及吞噬指数

吞噬率 每100个巨噬细胞中有吞噬CRBC的细胞数

在计数时应同时注意CRBC被消化的程度 Ⅰ级 未消化 胞质浅红或浅黄带绿色,胞核浅紫红色 Ⅱ级 轻度消化 胞质浅黄绿色,核固缩呈紫蓝色 Ⅲ级 重度消化 胞质淡染,核呈浅灰黄色 Ⅳ级 完全消化 巨噬细胞内只见形状似CRBC大小的空泡,边缘整齐,胞核隐约可见