Seminar I 蛋白质芯片研究进展 高 雁 指导老师：林炳承 研究员

内容提要 蛋白质芯片概述 蛋白质芯片的关键技术 蛋白质芯片的应用 展望

蛋白质芯片的定义 生 物 芯 片 基因芯片 蛋白质芯片 微流控芯片 蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。 Telechem International Inc ArrayIt 生物芯片的设想最早起始于80年代中期, 90年代美国Affymetrix公司实现了DNA探针分子的高密度集成,　这是一项融微电子、微机械、化学、物理、计算机技术等于一体,是生物学技术与其它学科相互交叉和渗透的产物. 生物芯片(B iochip)是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统,以实现对细胞、DNA、蛋白质、组织、糖类及其他生物组分进行快速、敏感、高效的处理和分析 DNA芯片 与蛋白芯片最大的区别是靶分子和探针分子的结构差异 相对于DNA 芯片, 蛋白质芯片技术面临更多困难。第一, 相对于DNA 的碱基配对杂交机制, 蛋白质之间的相互作用呈现出更强的变化性。而且, 蛋白质的活性以及相互作用的性质可能需要其它蛋白质的作用和翻译后修饰。第二, 相对于PCR 技术这样可以大量扩增DNA 的技术, 尚未有可以大量扩增蛋白质的成熟技术。第三, 蛋白质的表达和纯化工作十分艰巨, 而且经常不能保持蛋白质的完整功能。最后, 许多蛋白质很不稳定, 给阵列制作本身带来很大的困难。 多数蛋白芯片通过接触印记合成，大于30 000 点的高密度阵列可以通过已有的DNA 的点样设备来实 点间距为4. 5mm,点的直径250um,可以检测250nmol或l0Pg的待测蛋白质 Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822. Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 5400–5411. www.proteinmicroarrays.com/

研究蛋白质芯片的意义 蛋白质是基因表达的最终产物, 接近生命活动的物质层面； 探针蛋白特异性高、亲和力强, 可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测； 适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物； 有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。 它以蛋白质检测目的物,蛋白质是基因表达的最终产物,因而它比基因芯片更进一步的接近生命活动的物质层面, 由于蛋白质芯片的探针蛋白特异性高、亲和力强,所以对生物样品的要求较低,故可简化样品的前处理,甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测 同时,由于疾病的发生、发展与某些蛋白质的变化有关,所以利用蛋白质芯片还可直接筛选出与靶蛋白作用的化合物,从而大大推进药物的开发. 此外,蛋白质芯片有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用,从而促进药物学和毒理学研究的发展. 蛋白质芯片能同时检测生物样品中与某种疾病或环境因子损伤可能相关的全部蛋白质含量的变化情况即表型指纹,对监测疾病的进程和预后及判断治疗效果有重要意义.

蛋白质芯片的分类 蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 蛋白质芯片依照应用领域不同可分为两类: 蛋白质检测芯片和蛋白质功能芯片。 据检测方法不同可以进一步分为正相蛋白质检测芯片和反相蛋白质检测芯片 正相蛋白质检测芯片首先用不同的荧光标记物对样品中的拟研究的蛋白质进行标记, 再将这些样品在抗体微阵列上进行温育, 然后用生物芯片扫描仪检测各个阵列分子点上荧光信号。正相蛋白质检测芯片可以同时对同一样品的不同成分进行分析对比。但是需要注意在许多情况下, 蛋白质倾向于形成多蛋白质复合体, 所以如果出现很强的信号, 那么可能是由于蛋白质的浓度很高, 或是由于形成了大的蛋白质复合体。 反相蛋白质检测芯片 是用破碎的微量组织或者细胞样品点样制成的芯片, 代表在某种状态下整个细胞的蛋白质,然后用特定抗体进行检测。反相蛋白质检测芯片可以检测许多组织、细胞裂解液, 可以研究整个蛋白质组随时间的波动变化状态, 尤其是通路中的蛋白质何时被修饰、何时被激活。这种芯片检测的优点在于样品需要量小且不需要进行标记, 只需要检测抗体即可。然而它的缺点也在于此, 低点样量可能造成低丰度的蛋白质信号漏检 寻找与拟研究蛋白质相互作用的蛋白质、小分子, 或者寻找对蛋白质进行修饰的修饰酶, 以及寻找酶的底物等等 脂质体是由磷脂双层构成的具有水相内核的脂质微囊，目前脂质体已应用于研究蛋白质与生物膜的相互作用、生物膜中离子的转运、药物与膜受体作用、酶催化活性模拟、包载药物、基因转移等方面。 Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161–170.

蛋白质芯片的关键技术 1 2 6 3 5 4 提出生物学问题 蛋白质芯片制备 数据分析和建模 样品预处理 检测 生化反应 （实验目的） 蛋白质芯片制备 数据分析和建模 （图象量化，标准化， 采集蛋白信息，建立模型） 样品预处理 （重组蛋白，制备一、二级抗体， 荧光标记，配蛋白印记缓冲液） 6 3 检测 （荧光和比色扫描或拍照， 参数设置） 生化反应 化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件 5 4 Schena M, Protein microarrays,2005, 7.

蛋白质芯片的制备 固定微阵列上的蛋白样点 固相载体及其处理 蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解 点制微阵列 膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白 微阵列的封闭 主要封闭试剂：BSA或Gly 固相载体及其处理 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片） 蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解 点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解,保持在整个制作过程保持水合状态，维持生物活性 接触型点样仪适用于普通玻片, 喷射型点样仪适用于3D 表面和纳米井表面。使用电子喷雾贮存技术将干燥的蛋白质点样到有葡聚糖的表面, 可将点样直径从150 微米缩小到30 微米。 Gly 甘氨酸 光刻法主要是利用半导体持术,在合成碱基单体的5’- 羟基末端连接 上一个光敏保护基,利用光照射使羟基脱保护进行DNA的合成,在生长的链上加上一个碱基。 压电技术利用喷墨打印将毫微升积的试剂喷印到芯片的特定位点,利用电流将分子运送到固 相的表面,一个XYZ三维移动装置指导喷印头的定位。点样法则伪造与微阵列的直接表面接 触,利用由微点样针、毛细管或镊子组成的打印头将准备好的样品从样品槽中转移到固相的表 面。 李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33.

蛋白质芯片比较 表面 蛋白固定方式 优点 缺点 PVDF 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，分布随机 Nitrocellulose 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，高背景，低密度 无需蛋白修饰过程，高密度， 非特异吸附，分布随机 高分辨检测 Epoxy-activated 高密度，高分辨检测 分布随机，表面有吸附 PDMS nanowell 高密度，适合复杂的生化分析 Gold coated silicon 高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化 Avidin coated 亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化 Ni-NTA coated 亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记 表面蛋白分布均一容量 Agarose thin film 制作难，未商品化 3D gel pad Poly-lysine coated Aldehyde-coated 吸附，共 价偶联 共价 偶联 PVDF 聚二氟乙烯 lysine 赖氨酸 Aldehyde:醛, 乙醛 Avidin生物素 Ni-NTA 镍-硝基三乙酸（有两个开放的互补位 点可与组氨酸结合。 ） Nitrocellulose ]硝化纤维, Agarose 琼脂糖 扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量 Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology,2003,7,55-63.

蛋白质芯片检测 无探针标记检测法 探针标记检测法 表面增强激光解吸离子化技术 同位素标记检测 荧光标记检测 (Surface enhanced laser desorption/ionization, SELDI) 表面等离子体共振检测技术 （surface plasmon resonance, SPR） 原子力显微镜检测技术 （atomic force microscope, AFM ） 同位素标记检测 荧光标记检测 化学发光检测 酶免疫标记检测 胶体金标记检测 荧光标记的芯片采用激光共聚焦显微镜进行扫描，然后通过计算机分析出每个点的 平均荧光密度。 对酶标记的芯片，显色后用高精度的CCD扫描仪进行扫描 一旦荧光标记样品和微阵列反应后,未结合的成分就可洗去,结合到芯片的样品可通过荧 光检测装置进行检测。聚焦扫描仪和CCD相机均已成功地应用于芯片的检测。聚焦扫描仪 和CCD检测系统间一个关键性的不同点是后者经常使用连续波长的光源和弧灯,避免使用多 个激发器。一旦从芯片发出的荧光转换成数字输出后,数据文件就被定量和翻译,通过重叠芯 片像线栅,用软件对芯片上的每个点计算平均密度值,从而完成定量,通过对芯片上实验点和 对照点的比较,光密度值再进一步转换成生物相关的数据输出, 但是标记分子可能降低蛋白质的活性, 或者影响检测效果, 所以最好是不进行标记 SELDI技术是一种基于MALDI－TOF质谱发展起来的全新的检测技术，通过该技术可以很容易的获得与芯片上分子发生相互作用的样品分子的质量信息，由于样品分子被离子后是通过TOF（即飞行时间质谱）进行检测的，其分子量检测的范围从1000到30万Da分子量都可以实现。 SELDI 技术虽易于操作,可检测出不同样品的全部蛋白质的差异, 但是它不能检测高分子量蛋白质和膜蛋白质, 而且灵敏度比起免疫夹心法要低得多。 SPR是通过检测附着在金属薄膜表面的介质折射率的变化来获得与芯片表面分子相互作用的样品分子的信息的。当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，SPR谱（共振角的变化vs时间）能够很灵敏的反映与金属膜表面接触的体系的变化。 该技术的最大优点是：能实时、连续监测反应动态过程 原子力显微镜是利用原子之间的范德华力作用来呈现样品的表面特性。 下面通过一个实例来解释一下原子力显微镜的基本原理是：如图所示，激光器发出的激光束经过光学系统聚焦在微悬臂背面，并从微悬臂背面反射到检测器。微悬臂末端固定有特异性的抗体分子，在样品扫描时，由于样品表面的原子与微悬臂探针尖端的抗体分子间的相互作用力，微悬臂将随之发生弯曲起伏，反射光束也将随之偏移，因而，就能获得被测样品与抗体的相互作用信息。其检测范围可以达到nm级。 AFM技术可以通过检测芯片表面高度变化来揭示蛋白质之间的结合与否。 扫描探针显微镜以其分辨率极高（原子级分辨率）、实时、实空间、原位成像，对样品无特殊要求（不受其导电性、干燥度、形状、硬度、纯度等限制）、可在大气、常温环境甚至是溶液中成像、同时具备纳米操纵及加工功能、系统及配套相对简单、廉价等优点 描速度受到限制， 测效率较其他显微技术低；由于压电效应在保证定位精度前提下运动范围很小（目前难以突破100μm量级），而机械调节精度又无法与之衔接，故不能做到象电子显微镜的大范围连续变焦，定位和寻找特征结构比较困难；

蛋白质芯片的应用 疾病诊断和预警 药物开发 蛋白质组学

定量检测组织提取液中的肿瘤标记物 疾病诊断 孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原 微阵列方法与ELISA方法检出结果比较 uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子 VEGT 血管内皮生长因子 9*5阵列， 间隔600um ,喷墨技术 对50个乳癌核心组织切片样品进行 pG/mL检测限 人类约30，000个基因，编码30，000个蛋白。细胞内的蛋白分子量范围：10-125kDa Zhu 等[18]用含有5 800 个不同的酵母重组蛋白质的蛋白质芯片进行实验, 微阵列方法与ELISA方法检出结果比较 Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 1427–1436.

高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂 His6-RB/GST-E7相互作用抑制剂筛选微阵列图 药物开发 加入His6-RB 通过直接的相互作用，由人乳状瘤病毒产生的E7蛋白诱导眼癌抑制因子RB下降，表明阻碍二者相互作用的分子可能成为一种抗癌 加入含 PepC抑制剂的His6-RB A 1500 个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及SPR信号 Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.

人动脉平滑肌细胞蛋白谱 检出298个蛋白 蛋白质组学 4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相互作用分子）表达上调； 54个蛋白表达量发生变化 13.4%抗原（结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降 378 antibodies chip 密度脂蛋白胆固醇特别是氧化的低密度脂蛋白胆固醇及自由基都能刺激某种钙 离子通道的开放,促进钙离子进入血管平滑肌细胞和内皮细胞,而较高的细胞内钙离子浓度反 过来又能增加脂质过氧化物等自由基的产生 细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱 揭示了oxidized low density lipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式 Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 1274–1280.

存在的问题 成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器 芯片的标准化问题 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等 但是,蛋白芯片技术还只是在研发阶段,并没有转化为商品进行大量的使用,是因为该技术仍存在许多问题. 成本过高,目前的生物芯片技术需一系列昂贵的尖端仪器,如光刻机器、和激光共聚焦显微器等设备, 如Affymetrix的一套系统需要13. 5万美元,对普通的实验室来说开支较大,是生物芯片技术推广的一大障碍. 其次是芯片的标准化问题,即如何将不同实验室、不同操作人员做出的结果进行统一化、标准化, 如何提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等,这些都是亟待解决的问题

展望—蛋白质芯片未来的发展重点 建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。 改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。 提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。 研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。     蛋白质芯片还面临着诸多挑战，未来的发展重点集中在以下几个方面 人类基因组大规模测序工作已经完成，随着以功能基因组学和蛋白质组学为主要研究内容的后基因组时代来临，蛋白质芯片作为检测蛋白质存在和运动变化的高效工具，必将发挥越来越大的作用 ；第一代蛋白检测芯片将主要依赖于抗体和其他大分子，显然，用这些材料制备复杂的芯片，尤其是规模生产会存在很多实际问题，理想的解决办法是采用化学合成的方法大规模制备抗体。 提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。

参考文献 [1] Markus F, et al., DDT, 2002, 7,815-822. [2] Bertone P,et al., FEBS Journal, 2005, 272 , 5400–5411. [3] Poetz O et. al, Mechanisms of geing and Development, 2005, 126 ,161–170. [4] 李瑶，基因芯片与功能基因组，2004，32-33 [5] Zhu H et.al, Current Opinion in chemical Biology, 2003,755-63. [6] Weissenstein U, Proteomics 2006, 6, 1427–1436. [7] Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991. [8] Sukhanov S and Delafontaine P，Proteomics, 2005, 5, 1274–1280. [9] Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431. [10] Schena M, Protein microarrays,2005, 7.

谢谢！

蛋白质芯片检测信号的提高 优化芯片制作过程各种参数； 使用金粒子作为辅助标记分子； 添加SiO2和TiO2层提高表面反射 Au-labelled anti-rabbit IgG放大照片 Au 的尺寸及其与Dy633的比例 对信号的影响 5 nm Au-particle 10 nm Au-particle. 优化芯片参数包括print buffer, humidity control during arraying, and probe concentration.固定聚合物材质 Sauera U，et al., Sensors and Actuators B, 2005, 107, 178–183.

Protein Microarray System The Protein Microarray System is a complete microarray platform that includes microarray manufacturing, processing, surface chemistry, detection and analysis. It is suitable for a variety of proteomic applications including Micro Multianalyte Immunoassays, protein-antibody, antibody-protein, antibody-antigen, protein-protein, and protein-drug microarray assays. TeleChem / arrayit.com http://arrayit.com

G-蛋白偶联受体芯片 药物开发 肾上腺素受体芯片（含三个亚型）筛选抑制剂 抑制剂 Fang Y，et al., ChemBioChem 2002, 3, 987- 991.

SELDI把基质改为 www.evms.edu/vpc/ seldi/seldiprocess/