植物生物技术 河南农业大学生命科学 学院植物科学系

绪论 第一部分 植物组织培养 第二部分 植物基因工程 第三部分 植物分子标记 第一章 植物离体遗传操作技术 第二章 胚器官培养 第一部分 植物组织培养 第一章 植物离体遗传操作技术 第二章 胚器官培养 第三章 植物愈伤组织的诱导、继代及分化 第四章 植物体细胞无性系变异与植物改良 第五章 原生质体培养和体细胞杂交 第六章 单倍体细胞培养 第二部分 植物基因工程 第七章 植物基因克隆的原理与技术 第八章 植物遗传转化 第三部分 植物分子标记 第九章 分子遗传标记

（Molecular Genetic Marker） 第九章 分子遗传标记 （Molecular Genetic Marker）

本章主要内容 第一节 遗传标记 第二节 分子标记技术

第一节 遗传标记（Genetic marker） 是指可以稳定遗传的、易于识别的特殊的遗传多样性形式； 在经典遗传学中，遗传多样性是指等位基因的变（差）异； 在现代遗传学中，遗传多样性是指基因组中任何座位上的相对差异或者是DNA序列的差异。

一、遗传标记的类型 1、形态学标记（morphological marker） 2、细胞学标记(cytological marker) 3、生化标记(biochemical marker) 4、分子标记(molecular marker)：DNA分子遗传标记， 或DNA标记。

形态学标记 （morphological marker） 细胞学标记 (cytological marker) 生化标记 (biochemical marker) 分子标记 (molecular marker)

1、形态标记 形态标记是指那些能够用肉眼明确观测的一类外观特征性状， 如植株高矮、粒型、粒色、穗形、白化、变态叶等 从广义上讲，形态标记还包括色素、生理特性、生殖（育性） 特性、抗病虫性等有关的性状 形态标记简单直观，经济方便，容易观察记载 缺陷：数量少，难以建立饱和的遗传图，受环境影响大，有些 标记与发育不良性状连锁

2、细胞学标记 能明确显示遗传多样性的细胞学特征； 染色体数目的变化和染色体结构的变异（如缺失、易 位、倒位、重复等）常常会引起某些表型性状的异常， 染色体结构和数量变异常具有相应的形态学特征； 缺陷：鉴定困难，材料保存代价高；标记数目有限；难 以开展精细定位。

3、生化标记 生化标记包括同工酶和等位酶标记。同工酶是指一个以 上基因座位编码的酶的不同形式，而等位酶是指由一个 基因座位的不同等位基因编码的酶的不同分子形式。 分析方法是电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变 成肉眼可辩的酶谱带型。

优点：一是表现近中性，对生物经济性状一般没有大的不良影响； 二是直接反映了基因产物差异，受环境影响较小。 缺陷：一是某些酶的活性具有发育和组织特异性，可用标记数量 少，二是染色方法和电泳技术有一定难度。

4、分子标记 指在分子水平上可标识的遗传多态性 遗传多态性是指基因组中任何位点上的相对差异 DNA标记是指可标识核苷酸序列的多态性 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。

1）理想的分子标记应具有的特点 高水平的多态性 共显性遗传（可区分某一位点的的纯合或杂合状态） 在基因组中出现的频率高 在基因组中均匀分布 具有中性选择特征（即无多效性） 容易获得 容易而且可快速分析 重复性好 分离标记所需的费用低

2）分子标记的种类 分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为三大类: 第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括： ----限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）； ----DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）； ----- 原位杂交（in situ hybridization）等；

第二类是PCR反应为核心的分子标记技术，包括： -----随机扩增多态性DNA标记（Random amplification polymorphism DNA, 简称RAPD标记）； -----简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）； -----扩展片段长度多态性标记（Amplified fragment length polymorphism, 简称AFLP标记）； -----序列标签位点（Sequence tagged sites, 简称STS标记）； -----序列特征化扩增区域（Sequence charactered amplified region, 简称SCAR标记）等；

第三类是基于DNA测序的一些新型的分子标记，如： -----单核苷酸多态性（Single nuleotide polymorphism, 简 称SNP标记）； ----- 表达序列标签（Expressed sequences tags, 简称EST标 记）等。 应用最普遍的是RFLP, RAPD, AFLP和SSR。

第二节 分子标记技术 一、基于分子杂交技术的分子标记 Molecular Hybridization（核酸分子杂交）： 第二节 分子标记技术 一、基于分子杂交技术的分子标记 Molecular Hybridization（核酸分子杂交）： 不同来源的单链DNA与单链DNA间，在长于20bp的同源区域内，以氢键连接方式互补配对，形成稳定的双链结构的过程。

Southern blotting 通过琼脂糖凝胶电泳将这些片段按大小顺序分离开来；将它们按原来的顺序和位置转移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维膜 用放射性同位素（如P32）或非放射性物质（如生物素、地高辛等）标记的DNA作为探针，与膜上的DNA进行杂交（即Southern印迹杂交）

Southern blotting 程序 ① 基因组DNA的准备 ② 限制性内切酶消化 ③ 碱变性 ④ 琼脂糖凝胶电泳 ⑤ 转膜 ⑥ 探针标记 ⑦ 杂交 ⑧ 信号检测（放射自显影或荧光）

1、RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 1）基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产 生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA 作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出 多态性图谱。 自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。

EcoRⅠ酶切示意图 5’ AG----GAATTC---GAATTC----GAATTC---CG 3’ 3’ TC----CTTAAG---CTTAAG----CTTAAG---GC 5’ AG----G AATTC---G AATTC----G AATTC---CG TC----CTTAA G---CTTAA G----CTTAA G---GC

用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上 放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的 2）基本步骤： DNA提取 用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离限制性片段 将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上 用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上 的DNA杂交（称 Southern杂交） 放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的 限制性酶切片段多态性。

DNA探针标记可用： 放射性同位素， H3， P32，P33 非放射性物质， 生物素 荧光染料

RFLP是利用特定的限制性内切酶识别并切割（消化）不同生物个体的基因组DNA，由于不同个体等位基因之间碱基的互换、重排、缺失等变化导致限制性内切酶识别位点发生改变，从而造成基因型间限制性片段长度的差异。

A B A B 限制性内切酶位点 与放射性探针 结合部位 ①限制性内切酶酶切后； ②电泳分离DNA片段； ③转移至硝酸纤维素薄膜； ④与放射性探针杂交， ⑤分析阳性条带

3）RFLP标记的主要特点： ①遍布于整个基因组，数量几乎是无限的； ②无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制； ③共显性，可区分纯合子和杂合子； ④结果稳定、可靠； ⑤ DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。 ⑥非放射性物质信号相对较弱，放射性同位素灵敏，但不安全。

2、染色体原位杂交 原位杂交是分子杂交的一种，是在切片上进行的，能显微定位，即阳性物在哪个细胞都能看到，是理想的病理研究新手段，近来原位杂交已应用于日常病理活检。 染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。 目前发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization, 简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。

基本步骤： 制备探针； 染色体制片； 染色体处理与变性； 染色体与探针杂交； 显微检测。

染色体专一位点探针

荧光标记探针检测精子

二、基于PCR技术的分子标记 短核苷酸序列引物 耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）扩增目标 DNA序列 快捷、简易、灵敏等优点

聚合酶链式反应（PCR）的三个基本步骤

RAPD：Random amplification polymorphism DNA, （随机扩 增多态性） SSR： Simple sequence repeat（简单重复序列） ISSR：Inter-simple sequence repeat（简单序列重复区） SRAP：Sequence-related amplified polymorphism （序列相关扩增多态性） SCAR：Sequence charactered amplified region （序列特征化扩增） AFLP： Amplified fragment length polymorphism （扩展片段长度多态性） STS： Sequence tagged sites（序列标签位点）

1、RAPD，随机扩增多态性 1990年由Williams和Welsh提出的； 随机引物（arbitrary primer，8- 10bp）通过PCR扩增染色体组中的 DNA，所获得长度不同的DNA片段， 凝胶电泳分离扩增片段，经染色来 显示扩增片段的多态性。

RAPD的原理：遗传材料的基因组DNA如果在特定引物结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致PCR产物增加、缺少或发生分子量变化。若PCR产物增加或缺少，则产生RAPD标记。 RAPD的引物： （1）为随机引物 （2）序列较短（通常为10个核苷酸） （3）为一个寡核苷酸单链引物

与常规PCR的不同： A、引物长度短 常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。 B、退火温度低 RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37℃。

0.2kb 0.5kb 0.3kb 品系1 品系2 0.5kb 0.3kb 0.2kb 0.5kb 0.3kb × 0.2kb

亲本中国春小麦、节节麦双倍体和子代的RAPD电泳图谱 引物为S516: CTCTGCGCGT 泳道1为中国春小麦， 泳道2、二者的子代， 泳道3为节节麦。

RAPD的优缺点 优点： ①设计引物不需知道序列信息。 ②具有广泛适用性和通用性，一套引物可用于不同生物基因组分析。 ③用一个引物可扩增出多片段。 ④技术简单，需要样品量少，检测快速。 ⑤成本低。

RAPD的优缺点 缺点： ①显性标记，无法区别显性纯合体和杂合体。 ②对反应条件敏感，稳定性和重复性差。包括模板浓度、 Mg 2+浓度，PCR反应中条件的变化等。 ③存在共迁移问题。不同个体相同分子量的片段 不一定同源；一条带可能包含不同的产物。

2、 SCAR，序列特异性扩增区域 将目标RAPD片段（如与目的基因连锁的RAPD片段） 进行克隆并对其末端测序； 根据RAPD片段两端序列设计特定引物，通常为18- 24bp，一般引物前10个碱基应包括原来的RAPD扩增 所用的引物； 对基因组DNA片段进行PCR特异扩增； 具有更高的重复性和稳定性，共线性遗传。

3、 SSR（简单重复序列） 又称微卫星DNA，它是一类由1-6个碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置。 如（CA）n、(AT)n、(GC)n、(GATA)n等重复，n=10-60 微卫星DNA分散在基因组中，大多不存在于编码序列内，具有较高的多态性。呈现孟德尔式遗传。

原理 某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼两端互补序列人工设计合成引物，通过RCR反应扩增微卫星片段。 由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性。

该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。 微卫星DNA PCR扩增结果（示例）： 500bp 400bp 300bp 240bp 该结果显示在所检查的人群中，该位点多态性有4种。

特 点 （1）数量丰富，广泛分布于整个基因组； （2）具有较多的等位性变异； （3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子； （4）所需DNA量少，实验重复性好，结果可靠； （5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列 信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。

4、ISSR （简单序列重复区间）

用2、3或4个核苷酸序列为基元（motifs），以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基组成随机引物， 如（AC）nX、（TG）nX、（ATG）nX、（CTC）nX、（GAA）nX等（X代表非重复的锚定碱基） （AC）nX：X=C,T,G

原理：根据生物体广泛存在SSR特点，利用在生物基因组中常出现的SSR本身设计引物，无需预先克隆和测序。 用于扩增的引物一般由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，在PCR中，锚定引物可以引起特异位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表现。

优点： 开发费用降低 可以在不同的物种间通用 揭示的多态性较高 精确度几乎可与RFLP相媲美 检测非常方便 ISSR，一种非常有发展前途的分子标记

5、SRAP：序列相关扩增多态性 原理：根据基因外显子里GC含量丰富，而启动子、内含子里AT含量丰 富的特点进行。 上游引物长17bp，5’端的前10bp是一段填充序列，紧接着是CCGG，组 成核心序列及3’端3个选择碱基，对外显子进行特异扩增。 下游引物长18bp，5’端的前11bp是一段填充序列，紧接着是AATT，组 成核心序列及3’端3个选择碱基，对内含子区域、启动子区域进行特异 扩增。 因不同个体、物种的内含子、启动子及间隔区长度不同而产生多态性。 该标记具有简便、稳定、中等产率、便于克隆测序目标片段的特点。

三、基于PCR与限制性酶切技术结合的标记 AFLP ：Amplified fragment length polymorphism， 扩展片段长度多态性 CAPS: Cleaved amplified polymorphic sequences， 扩增片段限制性酶切长度多态性

1、AFLP：扩增片段长度多态性 1992年由荷兰Keygene公司的科学家Zabeau Mare和Vos Pieter发明并发展起来的一种选择扩增限制酶切片段的方法。 结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。

原 理 植物基因组DNA经限制性内切酶消化形成相对分子量大小不等的随机限制性酶切片段，随后将特定的接头连接在这些DNA片段两端，接头序列和邻近限制性酶切位点作为引物进行PCR扩增，最后通过PAGE分离扩增的特异限制性片段。 它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。

步 骤 (1) DNA酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA污染和抑制物质的存在； (2) 扩增反应； (3) 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离

AFLP引物：一种人工合成的单链寡核苷酸，一般长度为18~20个核 苷酸。引物主要由3部分组成： （1）核心序列（CORE），该序列与人工接头互补； （2）限制性内切酶识别特异序列（ENZ）； （3）选择性延伸序列（EXT），即引物3端的选择碱基，选择碱基延 伸到酶切片段区。 如：EcoRI引物和MseI引物 CORE ENZ EXT EcoRI 5 ´ -GACTGCGTACC AATTC NNN-3 ´ MseI 5 ´ -GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3´

优点： ① 信息量大，少量引物可获得较多标记，50-150条带 ② 多为显性标记或共显性标记，受环境影响小，无复等位效应 ③ 带型清晰，具高分别率 ④ 由于用两种引物经两步选择扩增，带型稳定，带纹丰富，灵 敏度高，重复性好 ⑤ 不需事先知道DNA序列信息

缺点： 施、配套仪器设备； DNA纯度和内切酶的质量要求较高。 ① 专利技术，试剂盒价格贵； ② 需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措 施、配套仪器设备； ③ 基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对 DNA纯度和内切酶的质量要求较高。

2、 CAPS，酶切扩增多态性序列 RCR-RFLP 原理： 利用已知位点的DNA序列资源（基因数据库、基因组或cDNA克隆以及克隆的RAPD条带等）设计一套特异的PCR引物（19-27bp），扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。

优点： ① 引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的 机会，而且操作简便，可用琼脂糖电泳分析。 ② 在真核生物钟，CAPS标记呈共显性，即可区分 纯合基因型和杂合基因型 ③ 所需DNA量极少 ④ 结果稳定可靠 ⑤ 操作简便、快捷、自动化程度高

STS 序列标签位点 STS是对以特异引物序列进行PCR扩增的一类分子标记的统称。 STS引物的设计主要是依据单拷贝的RFLP探针（长度为200-500bp），根据已知RFLP探针两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增。 RFLP-PCR

优点： ① 共显性遗传。 ② 很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的比较， 是沟通遗传图谱和物理图谱的中介。 ③ 特异序列的STS用来确定物理图谱及DNA片段排序 在染色体上的位置。 缺点： STS标记的开发依赖于序列分析及引物合成，成本仍显太高。

四、基于DNA芯片技术的分子标记 DNA芯片 又称生物集成模片、DNA阵列或寡核苷酸微芯片 由几百到几千个核苷酸片段以预先设计的排列方式固定在载玻片 或尼龙膜上而组成的密集的分子排列。 荧光标记的序列作探针，与芯片杂交，若能杂交上并发出不同荧 光，其荧光信号强度能被特别仪器扫描显微镜（如荧光扫描显微 镜）检测到。 四个基本要点：DNA方阵的构建、样品的制备、杂交和杂交图谱的检测及读出。

1、SNP：单核苷酸多态性 指由于基因组的某个位点上单个核苷酸的变异而产生的DNA序 列多态性。 而SNPs不包括碱基的插入与缺失。 根据人类基因组测序的结果，大约每隔191kb就会出现一个 SNP，在人类总长为3×10 9的DNA序列中，大约有16-32×10 6 个SNPs。 1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记（SNP）制备第 三代遗传连锁图的遗传标记。

2、SNPs基本特性 理论上，单碱基替换包括1个转换C/T(G/A)和3个颠换 ① 双等位型标记（dialleleic markers） 理论上，单碱基替换包括1个转换C/T(G/A)和3个颠换 C/A(G/T)、 C/G(G/C)、 A/T(T/A)等四种不同的类型。 频率各不相等，其中转换和颠换之比为2：1，而且第三、第四种类型很少，几乎无法检出。 ② 在DNA分子上分布不均匀 多在CpG位点上发生C/T的转换，约占总SNPs的25%，大多数的C是甲基化的，它能够自发脱氨基产生T。 在转录序列中SNPs的频率低于非转录序列中SNPs的频率，而且转录区的SNPs非同义突变的频率比其它突变类型的频率要低得多。

③ 有很高的密度 平均每1000个bp就有一个SNP，密度上达到了基因组‘“多态性位 点”数目的极限。 人类染色体上3×10 9 bp中SNPs总数可达300万个。 ④ 具有遗传稳定性 基于单核苷酸的突变，突变率为10-9，与微卫星等重复序列多态性相比，具有更高的遗传稳定性。 ⑤ SNPs的检测和分析易实现自动化 双等位型，只需+/-分析就可以确定，有利于发展自动化技术进行发规模的筛选或检测。

3、 优 点 ① 它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。 ② 与串联重复的微卫星位点相比，SNP是高度稳定的，尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。 ③ 部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。 ④ 易于进行自动化分析，缩短了研究时间。

分子标记技术在植物研究中的应用 分子遗传图谱的构建 遗传多样性与种质鉴定 重要农艺性状相关基因的定位 分子标记辅助选择 重要农艺性状的图位克隆

四、分子标记的应用 分子标记遗传图谱的构建和基因定位 分子标记对质量性状的基因定位 数量性状基因位点（QTL）分子标记对定位的研究 分子标记辅助选择育种 比较基因组分析 分子标记用于种质鉴定的研究

思 考 题 1、什么是遗传标记？遗传标记的类型有哪些？ 2、分子标记方法有哪些？各有何优缺点？ 思 考 题 1、什么是遗传标记？遗传标记的类型有哪些？ 2、分子标记方法有哪些？各有何优缺点？ 3、RAPD，AFLP，RFLP，SSR技术的原理是 什么？

谢谢! （本章内容结束）