对氟烷基因进行PCR-RFLP分析 报告人：钟俊标 组员：吴天养 肖志科 谢梅英 徐静韵 徐勇洁 许毅俊 叶挺潮 张秀华 张永明 郑氽海 Team worker 报告人：钟俊标 组员：吴天养 肖志科 谢梅英 徐静韵 徐勇洁 许毅俊 叶挺潮 张秀华 张永明 郑氽海 钟俊标 www.themegallery.com

目录 威胁与罪魁祸首 为民除害的主要手段 PCR-RFLP 技术步骤 结果与分析 总结

一、威胁与罪魁祸首 猪应激综合症(PSS)是一种由常染色体上的单隐性基因（Hal ｎ）控制的疾病，往往导致猪应激而突然死亡或宰后产生 PSE 肉，给养猪业造成极大损失,据报道，美国每年会因为 此而损失２．３亿～３．２亿美元.英国劣质肉损失约为全部 屠宰猪肉价值的2. 2%。

1、威胁 应激反应 生产性能 免疫反应 疾病、死亡 健康 抑制 衰竭 抵抗应激 营养代偿

2、罪魁祸首 氟烷基因（Hal） 又称骨骼肌兰尼定受体基因（RYR 1 )被定位于猪6 号染色体的6q11~ 6q12 处, 隐性纯合体表现对氟烷麻醉敏感因而称氟烷基因。

2、罪魁祸首 氟烷杂合子(HalNn ) 氟烷基因 氟烷阳性纯合 子(Halnn) 有害基因型，表现对氟烷麻醉敏感，会导致猪应激综合症PSS，产生PSE和DFD肉，是要设法剔除的目标。 携带氟烷隐性有害基因( H al n )，使得 Haln基因在种群中扩增，应及时淘汰这种杂合子个体, 确保种猪质量。 氟烷基因 氟烷杂合子(HalNn ) 氟烷阴性纯合 子(HalNN) 正常氟烷基因型，予以保留。

二、为民除害的主要手段 氟烷麻醉法 血液遗传标记选择法 PCR-RFLP 法 氟烷基因型的检测方法有3 种 Reality 一 氟烷麻醉法 Reality 二 血液遗传标记选择法 三 PCR-RFLP 法 Creativity

1、三种方法的比较 第一种方法是采用氟烷麻醉人工诱发猪的应激综合症, 活体鉴别猪应激敏感性, 但这种方法不能识别氟烷杂合子和氟烷阴性猪, 且误差大。 第二种方法的准确性亦不高。

1、三种方法的比较 第三种方法就是PCR-RFLP, 该方法能准确鉴定猪的氟烷基因型, 是目前应用较为广泛的一种DNA分子诊断方法。

2、何谓PCR-RFLP？ PCR是聚合酶链式反应的简称，是体外酶促合成特异 DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以 迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时 等特点。

2、何谓PCR-RFLP？ RFLP（限制性片段长度多态性）是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。RFLP比RAPD优越之处， 它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的，也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变或倒位、 还是由缺失、插入造成的。

2、何谓PCR-RFLP？ PCR-RFLP技术是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨，以检测其多态性。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。PCR-RFLP技术标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。但在多倍体植物中的应用有一定的局限性。

三、PCR-RFLP 技术的主要步骤 1. Step one 6.Step six 5.Step five 引物设计 2. Step two 提取DNA 酶切产物 电泳检测 6.Step six RFLP技术处理 引物设计 5.Step five 2. Step two 4. Step four PCR 产物电泳检测 PCR 扩增 3. Step three

1、研究材料 本研究所用试验动物为706 头种猪( 含28 头公猪) , 包括美系大白猪、美系长白猪、美系杜洛克猪和福建槐猪4 个品种。其中大白猪261 头, 长白猪265 头, 杜洛克猪140 头, 槐猪40 头.均取其猪耳组织抽取基因。

2、主要步骤 1、基因组提取 采用高盐法提取DNA, 取黄豆大小的猪耳组织, 用纸吸除上面酒精, 在离心管中剪碎,加入含Nacl、EDTA、SDS、蛋白酶K的裂解液混匀, 56度水浴过夜, 用6 mol/ L Nacl溶液和氯仿混合抽提, 经无水乙醇析出获得DNA 样品, 溶于ddH2 O 后置4度 保存备用。 ThemeGallery is a Design Digital Content & Contents mall developed by Guild Design Inc.

2、主要步骤 2、引物设计 120 5-'T CCA GT TT GCCACAGGT CCTACCA-3' 引物B 碱基序列 5-'AT T CACCGGAGT GGAGTCT CT GA G-3'

2、主要步骤 3、 PCR 扩增 PCR 反应体系: 10 X buffer , dNTP mix, 上下游引物( A和B），Taq 酶, 模板DNA, 灭菌ddH2O 。 反应条件: 首先94 度 预变性5 min;然后进行 35 个循环( 94 度 变性40 s; 55 度 退火30 s; 72 度延伸90 s) ; 再72度终延伸7 min; 最后4度 保存。 检测: 取PCR 产物, 加buffer 于1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测。

检测:酶切产物经4% 琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像分析系统上观察结果并照相 2、主要步骤 4、RFLP技术处理 内切酶HhaI, 10x Buffer, PCR 产物 RFLR 反应体系： 反应条件: 在37度水浴中孵育3 h 检测:酶切产物经4% 琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像分析系统上观察结果并照相

四、结果分析 1、氟烷基因型的判定 HhaI内切酶的识别位点为5 ′ -GCGC-3′。 1）当氟烷基因 受体未发突变时, 1 843 碱基为胞嘧啶C, 因此HhaI酶可把659 bp 片断酶切成493 bp 和166 bp 2 个带，即为氟烷阴性纯合子(HalNN ) 。

四、结果分析 2）当胞嘧啶突变为胸腺嘧啶T 时, 则HhaI酶不能识别, 因此只能看见1 条带, 为氟烷阳性纯合子(Halnn)。 3） 当DNA 1 条染色体上的DNA 分子发生突变, 而同源染色体DNA 分子正常时, HhaI酶只能识别1 个DNA 分子, 得到659, 493 和166 bp 3条带, 为氟烷杂合子(HalNn ) 。

四、结果分析 Hal NN被酶切成493 bp和166 bp2条带 Hal nn酶不能识别，电泳后为1条带(659 bp) Hal Nn酶识别1个DNA分子，电泳后为3条带(659 bp,493 bp,166 bp) HalNN HalNn Halnn 不突变 可识别 2个带 一条染色体突变 只识别一个DNA 3个带 两条染色体突变 不可识别 1个带

四、结果分析 例： 猪1-22号Hal基因的PCR-RFLP结果分析：泳道6，9，17号为Ｎｎ型，其余泳道为ＮＮ型

四、结果分析 2、本次实验的结果分析 图1 提取的基因组DNA 在1. 5%的琼脂糖凝胶电泳中的检测结果 图2氟烷基因PCR 产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳中的检测, 目的基因大小为659 bp, 长2 000 bp ( 图1)用高盐法在猪耳组织中提取的DNA 检测结果说明提取的基因组DNA 含量较高且蛋白杂质含量较少。 ( 图2)利用这些DNA 作模板扩增出的PCR产物检测结果中的目的条带清晰明亮且无杂带, 表明目的基因扩增效果良好。

由酶切后进行电泳、染色, 根据电泳图谱中的带型可判断个体氟烷基因型。 四、结果分析 由酶切后进行电泳、染色, 根据电泳图谱中的带型可判断个体氟烷基因型。 对目的基因进行HhaI 内切酶酶切的检测结果( 图3) 第7 孔为阴性对照, M 长2 000 bp，1-4孔为本实验检测结果，表明本次试验706 头猪的基因型均为显性纯合子HalNN ( 氟烷阴性个体) , 均不携带氟烷隐性基因( Haln ) 。从而表明外来品猪群中已很少存在携带隐性等位基因的个体。

Last part 总 结 请欣赏

五、总结 为什么要对猪群进行氟烷基因诊断 氟烷基因的NN 型个体的繁殖性能优于Nn 型和nn 型个体，隐性氟烷基因对猪的繁殖性能有一定的负面影响。 氟烷基因NN型的经产母猪产仔数和产活仔数均显著高于Nn和nn 型，研究表明氟烷隐性基因对猪的繁殖性能是有害的。 携带有n基因的母猪对应激因素高度敏感, 配种和怀孕期间受应激后难以配种和极易流产。

五、总结 为什么要对猪群进行氟烷基因诊断 应激综合症（ＰＳＳ）的发生是由氟烷基因的隐性突变引起的，该基因对繁殖力和肉质有负效应，而对瘦肉率具有正效应。 研究表明，遗传上控制猪瘦肉率高的基因往往同氟烷基因密切相关，所以表现瘦肉率越高的品种，该基因的频率就越高。

五、总结 现代的育种手段还不能准确定位和分离及其遗传规律，对瘦肉率的选择更多的依靠常规育种，所以在种猪的选择过程中，携带氟烷阳性基因的猪种容易被选种，使得Haln基因在种群中的扩增，给养殖业带来巨大的经济损失。

五、总结 为什么要对猪群进行氟烷基因诊断 为了避免这种损失，对猪群进行氟烷基因诊断具有重要的意义，从而淘汰这类不利等位基因、建立应激抵抗型种猪群, 以尽可能地降低由该基因造成的经济损失。

PCR-RFLP技术

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