生物化学课件 (供临床医学专业使用) 张丕显

Structure and Function of Protein 第 一 章 蛋白质的结构与功能 Structure and Function of Protein

概述 一、什么是蛋白质? 蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。

二、蛋白质的生物学重要性 1. 蛋白质是生物 体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。

2. 蛋白质具有重要的生物学功能 3. 氧化供能 1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递 3. 氧化供能

蛋 白 质 的 分 子 组 成 The Molecular Component of Protein 第 一 节 蛋 白 质 的 分 子 组 成 The Molecular Component of Protein

一、 组成蛋白质的元素 .主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。

蛋白质元素组成的特点 各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量 ( g % ) = 每克样品含氮克数× 6.25×100 1/16%

二、蛋白质的基本单位-氨基酸 (一)氨基酸的结构(通式) 存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种(20-22)，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）如图示。

α-氨基酸 L-氨基酸的通式 R CH3 丙氨酸 H 甘氨酸

COOH C H H2N R R:H 甘AA; R:CH3 丙AA R:CH-OH 苏AA CH3

(二）氨基酸的分类 非极性疏水性氨基酸 极性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸 * 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:

苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48 非极性疏水性氨基酸 甘氨酸 glycine Gly G 5.97 丙氨酸 alanine Ala A 6.00 缬氨酸 valine Val V 5.96 亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48 脯氨酸 proline Pro P 6.30 目 录

2. 极性中性氨基酸 色氨酸 tryptophan Try W 5.89 丝氨酸 serine Ser S 5.68 酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66 半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸 methionine Met M 5.74 天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸 threonine Thr T 5.60 目 录

天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97 3. 酸性氨基酸 天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97 谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22 4. 碱性氨基酸 赖氨酸 lysine Lys K 9.74 精氨酸 arginine Arg R 10.76 组氨酸 histidine His H 7.59 目 录

几种特殊氨基酸 脯氨酸 （亚氨基酸）

 半胱氨酸 + -HH 二硫键 胱氨酸

(三) 氨基酸的理化性质 1. 两性解离及等电点 pH>pI pH<pI + OH + H+ + OH + H+ pH=pI

等电点(pI) 氨基酸酸性解离和碱性解离的程度相等，分子所带的净电荷为零，此时溶液的pH值就称为该氨基酸的等电点 pI=1/2（pK1+pK2） 若一个aa有3个解离基因，则其pI为兼性离子两边pK的平均值 除碱性氨基酸外，其余氨基酸等电点均小于7

2.紫外吸收性质 色氨酸和酪氨酸在280nm波长附近对紫外光有最大吸收峰 据此可以通过测定蛋白质溶液280nm的吸光值快速测定其蛋白质含量

3.茚三酮反应 aa与水合茚三酮一起加热，生成蓝紫色的化合物，在570nm处有最大吸收。据此亦可用作aa含量分析

三. 氨基酸在蛋白质中的连接方式 * 以肽键相连接,肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基上的羟基与另一个氨基酸的-氨基上的氢原子脱水缩合而形成的化学键,如图示:

+ -HOH 甘氨酰甘氨酸 肽键

H O H2N C C OH H N H C COOH R1 R2 O C N H

* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。 * 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽…… * 由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。 * 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。

* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。 多肽链有两端 N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端

N末端 C末端 牛核糖核酸酶

. 几种生物活性肽 1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH)

H2O2 2GSH NADP+ GSH过氧化物酶 GSH还原酶 2H2O GSSG NADPH+H+

2. 多肽类激素及活性肽 体内许多激素属寡肽或多肽 神经肽(neuropeptide)

抗利尿素与催产素(9肽)、胰高血糖素（29肽）、脑啡肽（5肽）、 降钙素（32肽）、 ACTH（39肽）、胰岛素（51肽）肌肽（2肽）、 P物质（10肽、属神经肽类）、β内啡肽（31肽）

蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein 第 二 节 蛋 白 质 的 分 子 结 构 The Molecular Structure of Protein

蛋白质的分子结构包括 高级结构 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure) 高级结构

一、蛋白质的一级结构 .概念： .主要的化学键(主键) 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。 方向: N C; 或 NH2末端 羧基末端 .主要的化学键(主键) 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。

.提示：一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。它由遗传密码决定,其上有酶切位点,一级结构可测定,并不同种属间有同源性. 目 录

二、蛋白质的空间结构 指蛋白质分子空间的三维结构,即立体,空间的构象，在蛋白质分子中各元素围绕某些化学键进行旋转,从而形成各种空间排布及相互关系 (一).蛋白质的二级结构 1.肽键平面(肽单元,肽平面,酰胺平面) 是蛋白质的基本结构单位.如图:

肽键平面—形成二级结构的基础 参与肽键的6个原子C1、、C、O、N、H、C2位于同一平面，，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元 (peptide unit) 。

2.二级结构的概念与基本形式 A.概念:一条多肽链中局部原子的空间排佈 B.二级结构的基本形式 （1） -螺旋 (  -helix ) （2） -折叠 ( -pleated sheet ) （3） -转角 ( -turn ) （4）不规则卷曲 ( random coil )

-螺旋 目 录

主链原子构成螺旋的主体,侧链在其外部

β－折叠 肽键平面呈伸展的锯齿状排列,形成的结构称β－折叠。常为两条或两条以上伸展的多肽链侧向聚集在一起形成扇面状，故又称β－折叠片或β－片层

β－转角(β－turn) 结构特征 肽链出现1800回折的转角处结构称为β－转角 残基的N-H形成氢键 *常见于球状蛋白质分子表面 *第一个残基的C=O与第四个 残基的N-H形成氢键

不规则卷曲 环或卷曲结构 ：无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。 相对没有规律性的排布，但是其同样表现重要生物学功用。 环或卷曲结构 ：无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。 相对没有规律性的排布，但是其同样表现重要生物学功用。 C.二级结构的维系力:氢键

.模体 在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体(motif)。

钙结合蛋白中结合钙离子的模体 锌指结构

(二)、蛋白质的三级结构 1. 概念 一条多肽链中全部氨基酸残基(全部元素)的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。包括主链，側链的全部内容 氢键、离子键、疏水键等。 2.主要的化学键（维系力） 为非共价键，次级键 （盐键）

目 录

肌红蛋白 (Mb) 肌红蛋白为单肽链蛋白质，含153个氨基酸残基，它含有8个α螺旋区，依次称为A到H螺旋，并含有β转角及环-卷曲等二级结构。

（三）蛋白质的四级结构 1.概念 有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的四级结构.而每条多肽链被称为亚基 (subunit)。 (或蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。) 2.维系力 亚基之间的结合力有疏水作用， 以及氢键和离子键。

血红蛋白

第三节 蛋白质的分类 1．根据蛋白质的形状分为： ① 纤维蛋白质。 如丝蛋白、角蛋白等。 ② 球蛋白。如蛋清蛋白、酪蛋白等。 2．根据蛋白质的化学组成分为： ① 单纯蛋白质（其水解最终产物是α- 氨基酸）。 ② 结合蛋白质（α- 氨基酸 + 非蛋白质（辅基））。 辅基为糖时称为糖蛋白； 辅基为核酸时称为核蛋白； 辅基为血红素时称为血红素蛋白等。

第四节 蛋白质结构与功能的关系 一、蛋白质的一级结构与功能的关系 二、蛋白质的空间结构与功能的关系

一、蛋白质一级结构与功能的关系 .一级结构是空间构象的基础 牛核糖核酸酶的一级结构 二硫键

牛胰核糖核酸酶的变性与复性 尿素或盐酸胍 β-巯基乙醇 透析 有活性 无活性

一级结构不同的蛋白质功能不同 ACTH 促肾上腺素皮质激素 MSH 促黑激素

N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · ·C(146) 例：镰刀形红细胞贫血 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · ·C(146) HbS β 肽链 HbA β 肽 链 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · ·C(146) （谷AA） （颉AA） 这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。

HbS与HbA的区别 正常人：Glu 患者：Val Β-亚基第6位氨基酸

二、蛋白质空间结构与功能的关系 .肌红蛋白与血红蛋白的结构 目 录

.血红蛋白的构象变化与结合氧 Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。

肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线

* 协同效应(cooperativity) 一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity)

血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。 O2

变构效应(allosteric effect) 蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。

天然状态，有催化活性 去除尿素、 β-巯基乙醇 尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性

.蛋白质构象改变与疾病 蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。

蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。 这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。

疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。 PrPc α-螺旋 PrPsc β-折叠 正常 疯牛病

The Physical and Chemical Characters of Protein 第五节 蛋白质的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Protein

一、蛋白质两性解离和等电点 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 * 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。

Pr NH3+ OH- COO OH- NH3+ NH2 Pr Pr - H+ COO_ H+ COOH 两性离子 pH﹦pI 正离子 pH＜ pI 负离子 pH ＞ pI

蛋白质等电点 Protein pI Pepsin <1.0 Serum albumin 4.9 Urease 5.0 Hemoglobin 6.8 Myoglobin 7.0 Chymotrypsinogen 9.5 Lysozyme 11.0

二.蛋白质的胶体性质 蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。 * 蛋白质胶体稳定的因素 颗粒表面电荷 水化膜

溶液中蛋白质的聚合沉淀 水化膜 － + + － 带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质 酸 碱 酸 碱 脱水作用 不稳定的蛋白质颗粒 酸 碱 溶液中蛋白质的聚合沉淀

三.蛋白质的变性、沉淀和凝固 * 蛋白质的变性(denaturation) 在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。

变性的本质 —— 破坏非共价键（次级键）和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。 引起变性的因素:物理、化学与生物学因素如 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。

变性蛋白质的特点: 粘度增加，溶解度降低，易沉淀,易被蛋白酶降解,丧失生物学活性.

应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。

天然状态，有催化活性 去除尿素、 β-巯基乙醇 尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性

* 蛋白质沉淀 在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。 变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

四、蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。（与Trp Tyr有关）

⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 五、 蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 ⒉双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。

A、蛋白质的分离和纯化 （一）透析及超滤法 * 透析(dialysis) * 超滤法 生物化学技术： 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 * 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。

&.透析

（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。

* 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。

免疫沉淀 抗体 Protein A-agarose wash elution binding

（三）电泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。

几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

（四）层析 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。

蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。

目 录

目 录

（五）超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。

因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。

B、多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。

通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列

C、蛋白质空间结构测定 * 二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。

* 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance, NMR)是研究蛋白质三维空间结构最准确的方法。

根据蛋白质的氨基酸序列预测其三维空间结构 * 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。 * 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋白质空间结构的预测。

练习题 名词解释: 等电点 蛋白质一级结构