pKGTM: 基于lentivirus的 一步法诱导性shRNA表达系统 Presented by BioEverest Technologies 2009
pKGTM一步法诱导性shRNA表达系统的构建 (patent pending) pKGTM lentiviral 载体示意图
pKGTM与其它基于RNAi的knockdown技术的比较 siRNA 持续性表达lentiviral shRNA 其它诱导性表达lentiviral shRNA pKG™ One-step 诱导性表达 lentiviral shRNA 转入方式 效率 可诱导性 稳定细胞株 建立稳定株步数 挑选单克隆 体内应用 转染 低 否 N/A 感染 高 不一定 1 可能需要 是 2 需要 不需要
pKGTM在生物医学“loss-of-function”研究中的应用(一) - 建立可诱导性表达shRNA的稳定细胞株 - 高滴度pKGTM诱导性shRNA表达的lentiviral particles ( BioEverest提供) 一步感染目标细胞株 (1天) 筛选可诱导性表达shRNA稳定的细胞株 (puromycin 3-5天, 无需挑选克隆) 扩增, 建立可诱导性表达shRNA稳定的细胞株 (1-7天, 视细胞生长速度)
pKGTM在生物医学“loss-of-function”研究中的应用(二) - 体内和体外Dox诱导shRNA引起的knockdown效果- 体 外 体 内 图： pKG™一步可诱导性shRNA系统建立的稳定HCT116细胞中，在体外和体内（皮下异体移植）沉默癌基因PIK3CA。(A) pKG™一步可诱导性shRNA系统表达的慢病毒，在稳定的HCT116细胞中用Dox (100ng/ml, 72 h) 诱导沉默癌基因PIK3CA/p110alpha (Western Blot)； (B) 稳定诱导的HCT116细胞被皮下植入裸鼠体内后用含DOX饮水喂养（详情可查阅）。由WB对沉默基因的PIK3CA的表达和下游的磷酸化标记物（p473-AKT）作出评估。TetR表达作为上样量控制。用三组小鼠（+ / - DOX）进行了测试．
pKGTM在生物医学“loss-of-function”研究中的应用(三) - 体内和体外Dox诱导shRNA引起的phenotypes - 体 外 体 内 图：使用pKG诱导性shRNA表达系统沉默癌基因KRAS后，出现的在体外和体内的HCT116结肠癌细胞的生长抑制。（A）用pKG™-可诱导性KRAS shRNA转导的慢病毒而建立的稳定HCT116细胞做克隆形成试验，沉默癌基因KRAS (Dox 100ng/ml, 10 days) 导致肿瘤细胞体外生长抑制. （B）相同的细胞系被植入小鼠（皮下）, 植入10天后，肿瘤的大小约100 mm3. 然后小鼠被喂食含DOX的饮用水。肿瘤的大小每5天测量一次。观察到体内肿瘤生长抑制。
一步法诱导性shRNA表达系统的构建 (patent pending) bio 无Dox: tetR结合, 抑制shRNA表达(无泄露) 有Dox: tetR脱离, shRNA表达(去除可重新抑制) 5’ LTR U6 pTK 3’ LTR TRE shRNA codon tetR IRES Puro (Neo or GFP) 编码 shRNA 的DNA序列 Pol III shRNA 启动子 TK启动子 Dox 诱导性 tetR 结合反应元件 绝缘区 编码tetR序列 编码选择标志物序列
Tet-responsive element No Dox: TetR bounds to TRE that suppresses shRNA expression (minimal leakage) With Dox: TetR releases from TRE that triggers shRNA expression (reversible) 5’ LTR U6 shRNA codon pTK 3’ LTR TRE tetR IRES Neo shRNA seq Pol III sh/miRNA promoter TK promoter Tet-responsive element Insulator seq TetR cDNA Selective Marker in Mammalian cells