FLOW CYTOMERTY AND ITS APPLICATION ON MEDICAL SCIENCE SHI XUEGENG

FLOW CYTOMERTY 简称 FCM

L/M WBC+DC

E/M

FCM技术在国际上已被广泛的应用于 肿瘤 血液病 免疫性疾病 艾滋病 器官移植等方面 的常规临床检查中，并已成为上述疾病诊断、疾病监控、治疗选择、疗效判断和预后估计等至关重要、甚至唯一的方法。

近年WHO已公布了全新的血液淋巴组织肿瘤分类标准 见: 美国临床肿瘤协会举办“临床肿瘤杂志”（Journal of Clinical Oncology，Vo17 No12，1999：PP3835—3849）; 世界卫生组织肿瘤国际组织学分类手册（Springer—Verlay出版社，2000版）

新分类标准将传统的细胞组织形态学和临床特征与现代的免疫表型和遗传变异相整合，比现有的FAB白血病分类方案，多种淋巴瘤分类方案有明显的改进和提高。 目前已在欧美，日本等西方国家中开始逐步采用，成为血液肿瘤的国际标准分类方案。

新的WHO分类标准中 细胞免疫表型分析 主要是依靠 FCM 来检测

1978年 国家科委重点项目： 研制国内第一台激光流式细胞仪 1982年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生 1984年 国家科委组织科研成果的鉴定验收 1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖 1985年-灵敏度、信噪比、更多参数 流式分选仪研制 计算机四参数软件开发 样品制备、医学生物学应用

第一幅直方图：鸡红血细胞+蛙红血细胞

填补国内空白 全部采用国产元器件 培养了一批有综合能力的人才 促进了FCM先进技术在各领域应用 LXJ 流式细胞计 填补国内空白 全部采用国产元器件 培养了一批有综合能力的人才 促进了FCM先进技术在各领域应用

1984年在全国率先开设： 研究生课程 《分析细胞学技术》

一、FCM原理&仪器结构 二、FCM医学生物学应用

一、FCM原理&仪器结构 二、FCM医学生物学应用

Fluorescence Activated Cell Sorter

Ortho 30

FACS 420

FACScan

FACScalibur

FACStarPlus

FACSVantage

EPICS ALTRA

FC500

FACSAria

FCM细胞大群体的分析 高统计学精度 单细胞多参数相关分析 更多、更精确的信息 以往其它细胞学技术不可比拟的

1、FCM仪器的一般结构 2、细胞信号的检测与分析 3、FCM测量数据的处理

1、FCM仪器的一般结构 2、细胞信号的检测与分析 3、FCM测量数据的处理

( X、Y、Z三轴互为正交 ) 荧光１ＰＭＴ 细胞样品 荧光２ＰＭＴ 流动室 针孔装置 鞘液 荧光３ＰＭＴ 侧向散射光ＰＭＴ 前向散射光检测器 光束成形系统 充电环 负高压板 正高压板 激光２ 细胞分选 激光１ 收集器 收集器 废液收集器

TEM00

细胞分选 X、Y、Z三轴互为正交 荧光１ＰＭＴ 细胞样品 荧光２ＰＭＴ 流动室 针孔装置 鞘液 荧光３ＰＭＴ 侧向散射光ＰＭＴ 前向散射光检测器 光束成形系统 充电环 负高压板 正高压板 细胞分选 激光２ 激光１ 收集器 收集器 废液收集器

FCM关键技术 单细胞流 单细胞照明 单细胞检测

1、FCM仪器的一般结构 2、细胞信号的检测与分析 3、FCM测量数据的处理

荧光染料化学技术的发展 降低仪器造价 简化仪器设计 方便仪器调试、操作 推动FCM的应用 起着十分积极的作用。

1、FCM仪器的一般结构 2、细胞信号的检测与分析 3、FCM测量数据的处理

（1）FCM数据的存贮 List Mode

(2)FCM数据显示方式 a.单参数显示 单参数直方图表示的是一个测量参数与细胞数量间的统计分布关系

细胞多个测量参数中每一参数的测量数据都可整理为其统计分布，以分布直方图( distribution histogram ) 来显示。 图中横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。图中纵轴一般为细胞数。

b.双参数数据的显示 点阵图、等高线图、密度图和三维立体显示等

细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细胞数量的关系，更重要的是获得了这二参数之间的相关关系，其中包含了更多、更重要的生物学信息。

在FCM分析中，形态与结构相似、具备相同功能的细胞群体其测量值总是相近的。 这些细胞在单参数直方图上以一个分布峰出现。在双参数散点图上，测量值相近或离散的细胞群总表现为散点的密集或稀疏，这在等高线轮廓图上可用不同颜色或标有不同细胞数的各种曲线轮廓来表示。

要记住，在FCM数据显示中，结构和功能相同的细胞亚群总表现为集中分布的趋势。 不同的细胞亚群有其各自的分布区域。 Flow Sorting

c.多参数数据的显示、分析 若干个单参数直方图和各种不同组合的双参数数据显示来反映各种信息的。 多参数测量另一重要意义是通过有关参数进行“设门” ( gating)分析。 可以是单参数设门，也可以是双参数设门。通过设门来调阅其他参数的有关信息。

（一）ＦＣＭ仪器的原理 （二）ＦＣＭ样品制备技术 （一）ＦＣＭ仪器的原理 （二）ＦＣＭ样品制备技术

1.单个分散细胞悬液的制备 2.选择性分离细胞亚群 3.细胞荧光染色技术 1.单个分散细胞悬液的制备 2.选择性分离细胞亚群 3.细胞荧光染色技术

1.单个分散细胞悬液的制备

●酶消化法 ●机械法 ●化学试剂处理法

常用的酶类试剂 酶反应的条件 酶消化法的一般程序和步骤

●机械法： 剪碎法、网搓法、研磨法等

●化学试剂处理法： 将对细胞的贴壁粘连行为有重要作用的二价钙、镁离子结合掉，从而使细胞分散 常用的试剂：EDTA、EGTA、TPB等

评判细胞悬液制备的标准 细胞团块、细胞碎片尽可能少 细胞呈单个分散状态 分散过程中细胞的活性不受到明显的损害 以保证下一步的荧光染色处理。

2.选择性分离细胞亚群

利用细胞物理学特性差异 自然沉降法 密度梯度离心法 电泳法 离心鼓淘汰法 利用细胞吸咐等的生物学特性 利用选择性破坏部分细胞

MACS & FCM多参数分析

评判细胞分离结果的指标： 收获率：所得的细胞数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比 纯度：是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。

3.细胞荧光染色技术

注意:实际工作中 避免使用固定剂 尽可能减少离心和漂洗次数

FCM的荧光细胞化学过程要求有足够的特异性，即所用荧光染料与所感兴趣的细胞成份是否为特异性结合。 　　严格控制各种反应条件是保证反应特异性的重要因素。

在相同的条件下，荧光反应产物的量（荧光强度）与所研究的生化成份的含量或活性之间有严格的化学定量关系

一、FCM原理&仪器结构 二、FCM医学生物学应用

A.百分率计算（细胞群体组成） 各种阳性细胞所占的百分含量（%） 例如：CD3： 70 %淋巴细胞 CD19：10 %淋巴细胞 在各种生理、病理情况下的变化遵循一定的规律。

B.绝对计数 阳性群体的绝对数量（个细胞/微升） 例如：AIDS患者CD4＋50个细胞/ul血; CD34+造血干/祖细胞绝对计数

C.抗原分子表达绝对定量 抗体结合数量，若知道抗原与抗体结合的化合价，可以计算出抗原的表达量（个分子/细胞）。 例如：败血症患者：264个CD64抗原分子/个中性粒细胞

D.单细胞多色荧光分析 三色、四色或更多色荧光的检测 从多个不同角度更客观地更可靠地识别各类功能不同的细胞亚群 如：Th细胞，CD3+CD4+CD8-CD45+ 白血病细胞免疫表型分析等

E.膜、胞浆、核相关分析 膜免疫表型+细胞浆内功能状态 如：Th1/Th2细胞分析：cytokines的分泌 急性髓系白血病：膜抗原+胞浆MPO（髓过 氧化物酶）等 膜抗原表达+FISH：表型和核型

F. 可溶性物质分析 CBA系统（Cytometric Bead Assay） Luminex 100 系统 细胞因子、趋化因子、激素分子、蛋白激酶、过敏原、细胞信号传导相关蛋白和核苷酸片段等

一、细胞生物学中的应用

(一)细胞动力学中的应用 1. 细胞周期与细胞动力学参数测定 2. 丰富发展对细胞周期的认识 3. 理化因素及药物的细胞动力学作用机理 4. 研究抗肿瘤药物合理使用与配伍方案设计

细胞分化过程中同时分析其增殖过程的变化，常常可提供十分重要的信息。 通过检测和定量细胞膜上各种分化抗原。 (二)细胞分化研究 细胞分化过程中同时分析其增殖过程的变化，常常可提供十分重要的信息。 通过检测和定量细胞膜上各种分化抗原。

不同分化阶段的造血细胞 形态有其一定变化 膜分化抗原的不同组合 特殊抗原表达量的变化 不同分化阶段的造血细胞 形态有其一定变化 膜分化抗原的不同组合 特殊抗原表达量的变化

（三）细胞凋亡研究 细胞坏死( Necrosis ) 细胞凋亡( Apoptosis )

细胞凋亡过程中 形态学变化 细胞生化变化 细胞功能改变 FCM凋亡检测的基础和依据

流式核型分析( Flow karyotype ) 特定的染色体分选纯化 二. 细胞遗传学中的应用 流式核型分析( Flow karyotype ) 特定的染色体分选纯化

1. 各种免疫细胞的表型分析 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK淋巴细胞 巨噬细胞 DC等 三. 免疫学中的应用 1. 各种免疫细胞的表型分析 T淋巴细胞 B淋巴细胞 NK淋巴细胞 巨噬细胞 DC等

2. 杂交瘤细胞的筛选与克隆 3. 免疫活性细胞功能的测定 (1)混合淋巴细胞培养试验( MLC ) (2)细胞介导细胞毒试验 (3)细胞吞噬功能试验 (4)血清中自身免疫抗体的检测 (5)细胞因子（cytokines）的分泌能力

肿瘤细胞增殖动力学 DNA异倍体细胞群体 异倍体细胞多少 异倍体DNA偏离的程度 四. 肿瘤学中的应用 肿瘤细胞增殖动力学 DNA异倍体细胞群体 异倍体细胞多少 异倍体DNA偏离的程度

癌前病变 生物学行为：肿瘤生长、转移、 复发、化疗疗效 交界瘤 肿瘤细胞生物学特征 癌前病变 生物学行为：肿瘤生长、转移、 复发、化疗疗效 交界瘤

细胞DNA倍体测定 一个客观的、定量的指标 临床肿瘤病理不可缺少的一个方面

(一)各种血细胞的计数与分类 (二)各种造血细胞的研究 (三)血液病学中的应用 五. 血液学中的应用 (一)各种血细胞的计数与分类 (二)各种造血细胞的研究 (三)血液病学中的应用

各种膜抗原在正常造血细胞分化成熟过程的不同阶段或出现或消失，或表达增强，或表达降低，都遵循一定的规律 研究表明这些抗原都是具有一定生物学功能的效应分子，它们参与造血细胞发育成熟过程中的免疫应答和调控作用

造血干/祖细胞的分选纯化

白血病细胞 分化成熟受阻 增殖异常 凋亡障碍

白血病细胞“双表型”现象( Biphenotype ) 血病细胞作为一种恶性细胞 异常细胞的分化程序 “发育不同步”( Developmental Asynchronous ) “系列不保真性”( Lineage Infidelity )

细胞遗传学改变所致 分化过程中基因表达的异常 细胞功能和细胞表型等 一系列的异常 细胞遗传学改变所致 分化过程中基因表达的异常 细胞功能和细胞表型等 一系列的异常

1.白血病细胞免疫表型分析 细胞系抗原： B细胞系( CD19，CD20 ) T细胞系( CD7，CD3 ) 红细胞系( glycophorin A ) 巨核细胞系( CD61 )

ＷＨＯ血液淋巴组织肿瘤分类标准 美国临床肿瘤协会举办的“临床肿瘤杂志”（Journal of Clinical OncologyVo17 ＷＨＯ血液淋巴组织肿瘤分类标准 美国临床肿瘤协会举办的“临床肿瘤杂志”（Journal of Clinical OncologyVo17.No12，1999：PP3835—3849） 世界卫生组织肿瘤国际组织学分类手册（Springer—Verlay出版社，2000版）

MIC MICM 高度专业化的服务

Reverse Transcriptase Mutations Flexibility Reverse Transcriptase Mutations

Spectral - not Spatial Separation

Solid-Phase Kinetics

Solution-Phase Kinetics

BD FACSArray

谢谢！

2. 白血病细胞动力学 3. 白血病化疗效果分析 微小残留病变( MRD )检测 4. 白血病的诱导分化治疗 诱导凋亡治疗 5

高分辨流式细胞术是一种血液病理学检测方法，它利用先进的流式细胞术和产权独有的数据分析方法来为临床血液肿瘤提供一种早期和准确的诊断和分型手段

血液肿瘤的原发性诊断和鉴别 分型分期 疗效观察 残存瘤细胞检测 肿瘤复发的早期发现 骨髓移植后的成功与再生检测 早期而准确地发现异常的肿瘤细胞 血液肿瘤的原发性诊断和鉴别 分型分期 疗效观察 残存瘤细胞检测 肿瘤复发的早期发现 骨髓移植后的成功与再生检测