儿童白血病免疫分型与MRD监测 上海交通大学医学院附属 上海儿童医学中心 顾龙君

急性白血病诊断分型(MICM) 急性白血病形态学分型（FAB） ALL: AML: L1 M1 L2 M2（M2a, M2b） M4 (M4a, M4b, M4c, M4d) M5 （M5a, M5b） M6 M7

急性白血病诊断分型(MICM) 急性白血病免疫学分型 T系ALL: T1: CD2, CD5, CD7 T2: CD1, CD4, CD8, PanT T3: CD3, CD4, CD8, PanT B系ALL: 早期前B: HLA-DR, cCD79a，CD19, 早期前B: CD10+上述 前B型: CYIgH+上述 成熟B型: SmIg(, )

急性白血病诊断分型(MICM) 急性白血病免疫学分型 ANLL各亚型无明显特异性 髓系: CD13, CD14, CD33, CD15, CD16, MPO 红系: CD71, 血型糖蛋白 巨核系: CD41, CD42, CD68, PGP(b,  b/  a)

急性白血病诊断分型(MICM) 系列特异及系列敏感抗原 B-ALL T-ALL AML B 系列： CD19 100% -/+ -/+ 敏感性指标 cCD79a 99% 0 0 特异性指标   T 系列： CD7 -/+ 100% 25% 敏感性指标 cCD3 0 100% 0 特异性指标   髓系： CD13 -/+ -/+ 70% CD33 -/+ -/+ 70% CD117 0 0 70% 特异性指标 Anti-MPO 0 0 70% 特异性指标   Mega： CD41 0 0 <10% CD61 0 0 <10%   红系 Glyco A 0 0 <3%

急性白血病诊断分型(MICM) 急性白血病免疫分型初筛方案 CD19 CD7 CD13 cCD79a cCD3 CD33 Anti-MPO B 系列 ALL T系列ALL AML CD19 CD7 CD13 cCD79a cCD3 CD33 Anti-MPO

急性白血病诊断分型(MICM) 急性白血病免疫分型确定系列方案 B系列 ALL T 系列 ALL AML CD34 CD34 CD34 cμ TdT HLA-DR TdT CD14 CD10 CD15 CD45 Glycophorin A CD22 CD41 sIgM

急性白血病诊断分型(MICM) 细胞遗传学分型 染色体数量异常: 高二倍体(>46) 低二倍体(<46) 染色体构型异常: 染色体数量异常: 高二倍体(>46) 低二倍体(<46) 染色体构型异常: B系ALL: t(12;21), t(9;22),t(1;19),t(4;11) t(8;14),t(2;8),t(8;22) T系ALL: t(11;14),t(8;14),t(10;14),t(1;14), t(4;11) AML: t(8;21),inv(16),t(15;17),t(11;17), t(11;19), t(9;11), t(4;11), t(9;22),-7

急性白血病诊断分型(MICM)

急性白血病分子分型

微量残留病——MRD

微量残留病——MRD

MRD检测方法 流式细胞术 PCR：Ig/TCR重排， 基因突变 PCR：融合基因， 基因突变 FISH：特异染色体变异

流式细胞术检测MRD——白血病相关免疫表型 标记组合正常时只在胸腺 表达(CD3/TdT) 正常细胞内不表达的分子(E2A-PBX1) 标记组合和正常细胞不同(CD19/CD10/CD34/CD13)

流式细胞术检测MRD

Ig/TCR 基因重排 Germline V  J1 V  D  J 1 V1-J 1重排后 V 1-J1重排后 连接区 TCR γ和 δ 基因重排：胸腺皮质细胞的V-D-J重组：T细胞分化所致的TCR 多样性 Germline V  J1 V  D  J 1 V1-J 1重排后 V 1-J1重排后 连接区 连接区 T-ALL 分化受阻 分化受阻细胞的克隆性增殖 克隆内每个细胞连接区序列相同

Ig/TCR 基因重排 PCR 克隆性PCR产物测序 设计合成克隆特异探针或引物 实时定量PCR

融合基因

不同MRD检测方法的覆盖率和灵敏度 方法 ALL AML 流式细胞术 98%(10-4) 93%(10-3) PCR：Ig/TCR重排 90%(10-5) <10% PCR：融合基因 <50%(10-3～10-5) <30%(10-3～10-5) St. Jude Total 15: 481/482 (99.8%) 病人可以通过FCM和/或 Ig/TCR重排的PCR检测MRD，一例没有合适表型和克隆性Ig/TCR重排但有MLL-AF4

简便MRD 正常表达CD10和/或CD34的CD19+对皮质激素非常敏感 B-ALL通常 CD19+ CD10+或/和CD34 经过2周的诱导化疗这群细胞通常<0.01% B-ALL通常 CD19+ CD10+或/和CD34 诱导化疗15-26天时这群细胞可视为MRD 此时这群细胞的消失提示治疗反应好

为什么要检测MRD？

诱导、巩固不同时间点MRD转阴的％

诱导缓解治疗后MRD状态对无复发生存的影响

ALL患儿中不同临床因素对疗程中复发预后影响 Score P 诱导缓解后MRD 10.759 0.001 性别 2.071 0.150 WBC是否大于5万/uL 0.686 0.444 年龄是否大于10岁 0.137 0.711 FAB分型 3.368 0.186 是否有不良融合基因 6.017 0.014 是否有低倍体染色体 0.567 0.716 泼尼松窗口反应 8.915 0.003 诱导后达CR时间 0.588 0.682 诱导第19天骨髓 6.624 0.010

不同时间点MRD监测结果 小于0.01% 0.01%-0.1% 大于0.1% 诱导达CR后 103例 13例 8例 首次CR缓解后半年内 104例 6例 7例 首次CR后半年以后 98例 5例 9例

RFS和EFS结果 总的5年EFS和RFS分别为67.91±4.38%和80.15±4.02%，

不同时间点MRD的关系 CR半年内阳性 CR半年后阳性 诱导缓解后MRD阴性 4.5％ 6.8％ 诱导缓解后MRD阳性 47.4％ 42.1％ 诱导缓解后MRD大于0.1% 66.7％ 100.0％

CR后半年内和半年以后不同MRD结果 阴性 阳性 P 首次CR后半年内 RFS <0.01 EFS 首次CR后半年后 87.7±4.1% 58.3±14.2% <0.01 EFS 80.7±4.6% 25.6±13.8% 首次CR后半年后 92.0±3.6% 48.5±15.5% 85.6±4.5% 21.4±11.0% 94例ALL患儿在治疗过程MRD始终保持阴性，这部分患儿的5年RFS和EFS分别为93.8±3.2%和86.3±4.3%

BFM根据MRD重划分危险度的RFS

ALL复发——按MRD分组

诱导d15幼淋比率对EFS的影响

ALL-XH-99诱导d19不同％幼淋的频数

ALL-XH-99诱导d19不同％幼淋的pEFS

诱导治疗d19不同MRD的复发率

ALL-XH-99诱导CR时不同％幼淋的pEFS

不同水平MRD的RFS

不同水平MRD的EFS

ALL-XH-99 CR时不同水平MRD的pEFS

诱导治疗结束时不同MRD的复发风险

诱导29天 骨髓 MRD < .01% 预示预后良好 (COG,n=1960) 1.0 881% 4 y EFS 0.8 685% 0.6 515% Event-free survival probability 0.4 P < 0.0001 0.2 1: Day 28 Negative (n=1579) 2: Day 28 0.01-0.1% (n=173) 3: Day 28 >0.1% (n=208) 0.0 1 2 3 4 5 6 Years

诱导缓解治疗第8天MRD 诱导缓解治疗后MRD 诱导缓解治疗第29天MRD 巩固治疗后MRD

MRD在个体化治疗的作用

MRD检测时间点 BFM 协作组 1998年大规模前瞻性MRD研究 PCR9个时间点 MRD

MRD检测时间点 BFM — AIEOP 2000 T1 (诱导治疗结束时） T2 (巩固治疗前）

MRD决定危险度分型 危险度分型和再分型： SR－T1、T2 MRD均阴性 HR－T1、T2 MRD均 0.1% Ph(+),t(4;11)或 诱导失败

MRD决定危险度分型 三、治疗因素 3 按MRD行危险度再分型作个体化治疗 T1－T9，以T1，T2最有意义（BFM） T1，T2均<0.01％ LR T1，T2均>0.1％ HR T1，T2 0.01～0.1% MR 三组3年复发率2％，75％和23％（XH-99 240例） T1 MRD识别LR-ALL预后，T2提供MR-ALL预后

St . Jude 研究小组 预后优良 初发 49% MRD(-) 15天MRD 50% MRD(+) CR--MRD 14周 MRD

MRD为基础的危险度分组 ——SCMC-ALL2005 低 危 中 危 d8 PPR or d19 m2 d8 PGR & d19 M1 低 危 中 危 d8 PPR or d19 m2 d8 PGR & d19 M1 低 危 中 危 诱导失败 d35 MRD d35 MRD ≥1% <0.01% 0.01~0.999% <1% ≥1% 低 危 中 危 高 危

低 诱导35天MRD 中 高 超高 低 中 高 移植组 <0.01 0.01~0.09 0.1-0.99 ≥1 ≥ 1