GENE COMPANY LTD 2003年8月 For 江西日博公司 分子生物学实验流程及相关试剂、仪器概述 GENE COMPANY LTD 2003年8月 For 江西日博公司

分子生物学实验概述 生物样品（细胞、组织、细菌） 细胞调节 神经科学 分子诊断 DNA分离 RNA分离 质粒DNA 噬菌体DNA mRNA cDNA DNA测序 重组DNA PCR 遗传鉴定 DNA标记 突变 基因表达

分子生物学实验概述（续） 基因表达 报告基因载体 体外转录 基因转化 真核转录 翻译 报告基因检测 蛋白 蛋白分析 蛋白分离

分子生物学主要实验流程 实验起始材料的选取和准备 mRNA的提取、纯化 目标片段的克隆和分析 DNA、RNA的提取、纯化和分析 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析 基因转化实验及转基因结果分析

实验起始材料的选取和准备

实验起始材料的选取和准备 人工气候箱、制冰机 分离准备工作 超净工作台、显微操作系统 水稻卵细胞的分离 RNase 抑制剂 RNase-free 耗材、液氮罐 材料的速冻 超低温冰箱 长期保存

卵细胞mRNA的提取、纯化 200℃ 烘箱 Oligotex系列试剂盒 细胞裂解 旋涡混匀器 匀浆 DEPC 、 RNase-free DNase I 、 RNase-free 耗材 离心机 去蛋白和细胞残渣 恒温水浴锅 温浴并结合 离心机、旋涡混匀器 洗脱 去盐和回收

目标片段的克隆和分析 利用SMART cDNA文库构建试剂盒构建水稻卵细胞cDNA文库 目标基因的获得 通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体克隆获得目标质粒 利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序

通过SMART技术构建cDNA文库 恒温水浴锅、制冰机 第一链的合成 RTase、RNase抑制剂 PCR仪 第二链的合成和扩增 高保真Taq酶 恒温水浴锅、离心机 酶切、纯化和片段分离 限制性内切酶、过滤柱 电泳仪器、凝胶成像系统 cDNA检测 琼脂糖 恒温水浴锅 插入载体并包装 培养基 超净工作台、烘箱、PCR仪 文库质量检测 超低温冰箱 文库扩增及保藏 DMSO

目标基因的克隆 利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文库目标基因的筛选 利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因 通过5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目标基因

通过核酸杂交和免疫反应筛库 将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙膜，并于核酸交联仪中固定。在杂交箱中利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗膜（探针标记：放射性和非放射性） 将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的表达并印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行杂交

利用PCR技术获得目标基因 利用GSP，以文库为模板通过PCR扩增出目标基因，并通过电泳、凝胶成像系统检测 利用文库载体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和GSP，通过5’RACE和3’RACE扩增出目标基因的5’和3’端序列。并通过电泳、凝胶成像系统检测

DNA、RNA的提取、纯化和分析 包含有目标基因的质粒的获得 水稻基因组DNA的提取、纯化和分析 水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析

包含有目标基因的质粒的获得 对于通过筛库技术获得的目标基因 通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒 对于通过PCR技术获得的目标基因 通过回收纯化后利用T载体等克隆并转化细菌 铺板培养后通过蓝白斑，原位裂解杂交分离出含有目标质粒的单个菌落

对于通过PCR技术获得的目标基因

对于通过PCR技术获得的目标基因 PCR仪 PCR或RACE Taq酶、薄壁管、矿物油 电泳仪器 琼脂水平电泳 琼脂糖 凝胶成像系统、手提紫外灯 长波紫外观察箱 PCR回收试剂盒 胶回收试剂盒 恒温水浴锅、离心机

对于通过PCR技术获得的目标基因（续） 纯化产物 测序仪 PCR产物测序 T载体、平末端载体连接 低温冰箱 感受态细胞、培养基、 抗生素 超净工作台、电转化仪 细菌转化、铺板培养 X-gal、IPTG、 尼龙膜和探针 杂交箱、恒温摇床、低温冰箱 蓝白斑筛选、菌落原位杂交 限制性内切酶 离心机、恒温水浴锅 质粒提取、酶切分析、测序

质粒提取、分析 常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙醇沉淀质粒DNA 质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切 电泳，用凝胶成像系统分析 测序

水稻基因组DNA的提取、 纯化和分析 利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质的原理提取基因组DNA 利用酚-氯仿抽提或过滤柱纯化基因组DNA 水稻基因组文库的构建 利用特异的探针，通过Southern blotting检测目标基因的拷贝数

水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析 分离所需的水稻各器官组织，并利用Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA：将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA 在RNase-free的情况下，通过甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量 利用特异性的探针，通过Northern blotting检测目标基因在各器官的表达情况

Southern blotting和Northern blotting 限制性内切酶、恒温水浴锅 基因组DNA完全消化 探针制备 同位素检测仪 琼脂水平电泳 比活性测定 探针制备试剂盒 手提紫外灯、电泳仪器 真空转膜仪 印迹转膜 尼龙膜 DNA交联 紫外交联仪

Southern blotting和Northern blotting（续） 制备好的尼龙膜 探针（放射性或非放射性） 杂交箱 杂交 同位素检测仪 磷屏成像系统 放射自显影 荧光 荧光扫描 成像系统

克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析

克隆化基因的表达 基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一致的DNA片段（通过测序确证） 体内表达：选择合适的表达载体插入目标片段。利用化学方法或电转化仪等手段转入细胞表达 体外转录和翻译系统：兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物等

表达蛋白的纯化 SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰胺胶分离不同大小的的蛋白。 利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和树脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白，利用亲和层析洗脱出目标蛋白 自动核酸/蛋白纯化工作站

目标蛋白功能分析 抗体的制备：多抗、单抗 DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等 蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交系统、噬菌体表面展示技术等

蛋白体内表达研究 Western blotting：利用抗原-抗体反应，对蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定量 免疫组织化学研究：通过切片技术和免疫反应，利用特异抗体检测特定蛋白在组织细胞内的表达和定位 蛋白质芯片系统

基因转化实验和转基因结果分析 转基因载体的构建：载体、农杆菌、特殊抗生素 植株的转化：叶盘转化法、基因枪 植株的筛选：荧光检测、GUS染色、PCR法 基因功能分析：激光共聚焦显微镜、FISH等

部分分子生物学实验必需仪器 纯水仪 移液器 pH计 电子天平 生化培养箱 灭菌锅

谢 谢