第九章 微生物的分类、鉴定 Taxonomy、Identification

微生物分类鉴定目的 分类是人类认识微生物，进而利用和改造微生物的一种手段，微生物工作者只有在掌握了分类学知识的基础上，才能对纷繁的微生物类群有一清晰的轮廊，了解其亲缘关系与演化关系，为人类开发利用微生物资源提供依据。

第一节 微 生 物 分 类 学 微生物分类学(Taxonomy) 是一门按微生物类群的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群（Taxon）的科学 分类学的任务 分类（Classification）：是指根据相似性或亲缘关系，将一个生命有机体放在一个单元中 命名（Nomenclature）：是按照国际命名法规给予生命有机体一个科学的名称 鉴定（Identification）：是指确定一个新分离物是否归属于某个已命名的分类单元的过程。

一、微生物的分类单位（单元） 界（Kingdom） 门（Phylum or Division） 纲（Class） 目（Order） 科（Family） 属（Genus） 种（Species） 种是最基本的分类单位。 但分类单元之间可加入亚门、亚纲、亚目、亚科等次要分类单位。种以下又可分为亚种、变种、型、菌株等

在种内，有些菌株在遗传学上关系密切，而且在表型上仅存在较小的某些差异，在种内分成2个或2个以上的分类单位，即为亚种 微生物种与亚种的概念 种(Species) ：难下定义，无公认的 凡是于典型培养菌紧密相同的其他培养菌统一起来，区分为细菌的一个种（Species），即是以某个“典型菌株”为代表、十分类似的、与同属的其它物种有着明显差异的一大群菌株的总称。1987年，国际细菌分类委员会颁布，DNA同源≧ 70%，而且其Tm≦5oC的菌群为一个种 典型菌株（模式种）：在微生物中作为一个种的典型、具体代表的菌株。 在微生物中，种还是一个抽象的概念，具有该种的许多典型性状的模式菌株才是具体的种。 亚种（Subspecies) 在种内，有些菌株在遗传学上关系密切，而且在表型上仅存在较小的某些差异，在种内分成2个或2个以上的分类单位，即为亚种

微生物亚种以下的变型分类 亚种以下 生物变型——表示特殊的生化或生理特征 血清变型——表示抗原结构不同 致病变型——表示某些寄主的专一致病性 噬菌变型——表示对噬菌体的特异性反应 形态变型——表示特殊的形态特征

微 生 物 的 菌 株 菌株(Strain)或称品系 是指同种微生物不同来源的纯培养物即单个分离物的纯培养后代，常以数字、字母、人名或地名等表示 一种微生物的每一不同来源的纯培养物或纯分离物均可称为菌种的一个菌株。 （1）菌株数目几乎是无数的 （2）是遗传型纯的谱系 （3）同一菌种的不同菌株间，主要性状相同，其他次要性状可能相差较大 （4）菌株变异应表以新的菌株 （5）实际应用菌种时都要在种的后面标出该菌株的名称

分离物是指已分离得到但未经鉴定的纯培养物的后代即为分离物 群(Group) 为工作方便而将近似的种或介于种间的菌株按其形态或结合生理生化、生态特征归为若干类群。如放线菌中的链霉菌属内的种归为12个类群

二、微 生 物 的 命 名1 微生物名称有俗名（地区性）和学名（科学） 微生物的命名按国际命名法命名，即Linna所创立的“双名法” 每一种微生物都用属与种命名，由2个拉丁词或希腊词或拉丁化了的其他文字组成。属名和种名用斜体表达 属名在前，用拉丁名词表示微生物的构造、形态、某科学家名字等，描述微生物的主要特征。第一字母大写 种名在后，第一字母小写。用拉丁形容词表示，描述微生物的色素、形状、来源、病名、地名、某科学家的名字等等 在种名后，附上首次命名者的姓、现名定名人和命名年份 （正体），可省略。 Bacillus subtilis（Ehrenberg） Cohn 1872

微 生 物 的 命 名2 如命名对象是新种，需在种名后加sp.nov 或nov.sp(即nova species) 如仅泛指某一属的微生物，或某属微生物内的某些种，则在属名后用sp.（单数时）或spp.（复数时）

当某种微生物是一个亚种（简称subsp）或变种（var）时，学名应按三名法命名。 Staphylococcus aureus Rosenbach 1884 属名：葡萄球菌 种名：金黄色 命名者姓 命名年份 Bacillus thuringiensis（subsp）galleria Bacillus subtilis var. niger Desulfotomaculum thermoacetoxidans n. sp. Strain CAMZ

三、微生物系统发育分析 由于现代分子生物学技术的迅速发展，正在形成一套与传统的分类鉴定方法完全不同的分类鉴定技术与方法，从基因水平上分析各微生物种之间的亲缘关系，即系统发育地位。 原核生物细胞中的16S rDNA 和真核生物细胞中的18S rDNA的碱基序列都是十分保守的，不受微生物所处环境条件的变化、营养物质的丰缺的影响而有所变化，都可以看作为生物进化的时间标尺，记录着生物进化的真实痕迹。因此，分析原核生物细胞中的16S rDNA 和真核生物细胞中的18S rDNA的碱基序列，比较所分析的微生物与其他微生物种之间16S rDNA和18S rDNA序列的同源性，可以真实地揭示它们亲缘关系的距离和系统发育地位。

系统发育研究方法 除了选择16S rDNA和18S rDNA作序列分析进行系统发育比较外， 还可利用间隔序列(ITS)、某些发育较为古老而序列又较稳定的特异性酶的基因作序列分析，进行系统发育分析。 如在环境微生物研究中，对于谷胱甘肽转移酶（GST）的基因序列分析所获得的系统发育鉴定结果与用其他方法所获得的结果具有十分吻合的一致性。

系统学（systematics） 系统学（systematics）是研究生物多样性及其分类和演化关系的科学。 分子系统学是检测、描述并揭示生物在分子水平上的多样性及其演化规律的科学。研究内容包括了群体遗传结构、分类学、系统发育和分子进化等领域。 群体遗传结构(population genetic structure)是指一个种内总的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，是一个种最基础的遗传信息。 分类学(taxonomy)是研究物种的界定和序级确定。系统发育关系(phylogenetic relationship)和分子进化(molecular evolution)是两个密切相关的过程。 在利用现代分子生物学技术在分子和基因水平上获得大量的分类单元尤其是种的遗传信息后，来推断和重建微生物类群的演化历史和演化关系，即建立系统发育树。

第二节 原核微生物分类系统 一、原核微生物伯杰氏分类系统 《伯杰氏细菌鉴定手册》 《伯杰氏系统细菌学手册》（1980起，1984-1989年陆续分四卷出版，第二版2000分5卷陆续发行，古细菌两个门，细菌16个门）

细 菌 分 类 系 统 最有代表性和最有影响的细菌分类系统 《伯杰氏细菌鉴定手册》 （Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology) 1923年, 1925年, 1930年, 1934年, 1939年, 1948年, 1957年, 1974年分别出版了第一至第八版，1994年出了第九版 以形态、生理生化、G + C mol%、生态分布等特征为主

《伯杰氏系统细菌学手册》（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology) second edition 2001 以生理生化、G + C mol%、系统发育地位等为主——体现了现代分子生物学的研究成果 尚未出齐

细菌的分类高级单位 原核生物界（Procaryotae) 薄壁菌门(Gracilicutes) 暗细菌纲 (Scotobacteria) 无氧光细菌纲(Anoxyphotobacteria) 产氧光细菌纲(Oxyphotobacteria) 厚壁菌门(Fimicutes) 厚壁菌纲(Fimibacteria) 放线菌纲 (Thallobacteria) 软壁菌纲(Tenericutes) 柔膜菌纲 (Mollicutes) 疵壁菌门(Mendosicutes) 古细菌纲(Archarbacteria)

关于变形细菌(Proteobacteria)纲 1 运用DNA/RNA杂交、16S rRNA编目法和16S rRNA序列分析方法对革兰氏阴性细菌系统发育研究的结果相当一致。在研究过程中，发现“紫细菌和相关细菌”，尽管在表型和基因型方面很不一样即相当异源，但在系统发育树状图谱上具有连续现象，相互之间的进化关系很为密切。1988年，Stackebrandt等将这类革兰氏阴性细菌命名为“变形细菌”（Proteobacteria），其下由a-亚纲、b-亚纲，g-亚纲、d-亚纲和e-亚纲。

关于变形细菌(Proteobacteria)纲 2 a-亚纲包括一大群形态、生理和营养类型（光能自养型、化能无机营养型和化能有机营养型）等表型特征十分不同的细菌，如土壤杆菌（Agrobacterium）、根瘤菌(Rhizobium)、红假单胞菌(Rhodopseudomonas)、发酵单胞菌(Zymomonas)、副球菌等(Paracoccus)、立克次氏体（Rickettsia）等。 b-亚纲由Woese于1984年提出，包括的菌群有色杆菌属(Chromobacterium)，水螺菌属(Aquaspirillum)，紫色杆菌(Janthinobacterium)，德克斯氏菌(Derxia)，丛毛单胞菌(Comamonas)，嗜木杆菌（Xylophilus）等。 g-亚纲由Weose1985年提出，包括了肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，气单胞菌科(Aeromonadaceae)，弧菌科(Vibrionaceae)，巴斯德菌科(Pasteurellaceae)，假单胞菌(Pseudomonas)，海洋螺菌(Oceanospirillum)，黄单胞菌(Xanthomonas)，溶杆菌(Lysobacter)等 d-亚纲由分解代谢的硫酸盐还原细菌、元素硫还原细菌，蛭弧菌(Bdellovibrio)和黏细菌目(Myxococcales)的6个代表。 e-亚纲仅有弯曲杆菌(Campylobacter)和螺杆菌(Heliobacter)2属。

二、Ainsworth等人的菌物分类系统纲要 90年代初，提出以菌物代替真菌，目前认为菌物与真菌两者的关系是： 粘菌门 假菌门（卵菌类） 真菌门 菌物界 （Mycetalia）

第七版（1983） 鞭毛菌亚门 粘菌门 菌物界 接合菌亚门 子囊菌亚门:无纲,直接分37个目 真菌门 担子菌亚门 半知菌亚门 壶菌纲 丝壶菌纲 鞭毛菌亚门 粘菌门 卵菌纲 接合菌纲 菌物界 接合菌亚门 毛菌纲 子囊菌亚门:无纲,直接分37个目 真菌门 层菌纲 腹菌纲 担子菌亚门 锈菌纲 黑粉菌纲 腔孢菌纲 半知菌亚门 丝孢菌纲

第八版(1995年): 原生动物界 假菌界 真核生物域 真菌界 集孢粘菌门 网柱粘菌门 粘菌门 肿根菌门 丝壶菌门 网粘菌门 卵菌纲 子囊菌门 担子菌门 壶菌门 真菌界 接合菌门 有丝煲真菌类

第三节 原核微生物的分类鉴定方法 Classification and Identification of Procaryotes

微生物的分类技术水平 微生物分类中使用的技术水平 细胞形态水平 细胞组分水平 蛋白质水平 基因组水平

微生物的分类方法 1 经典分类鉴定法 形态特征：个体 群体 形态特征：个体 群体 生理生化特征：营养要求（碳源，氮源，生 长因子）；代谢产物（种类，产量，显色反应等）；酶（产酶种类，反应特性等） 生态学特征：生长温度，对氧需要，酸碱要求，宿主种类等 血清学反应 噬菌体的敏感性 其他

微生物的微型、简便、快速或自动化鉴定系统 API细菌数值鉴定系统：同时鉴定20项以上生化指标，可鉴定细菌700多种 Enterotube系统：肠管系统 Biolog 全自动和手动细菌鉴定系统 ：1140种细菌和酵母菌

微生物的分类方法2 数值分类法又称阿得逊氏法（Adansonian classification) 以两两菌株的形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性及生态特征为依据由计算机计算两者之间的总近似值，列出相似值矩阵，将相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱（Dendrogram)的分类方法。

微生物的分类方法3 化学分类法（Chemotaxonomy） 根据微生物细胞的特征性化学组成成分对微生物进行的分类方法 细胞壁成分、全细胞水解液的糖型、磷酸类脂成分、枝菌酸、醌类、气相色谱技术等

细菌含量变化范围在25%~75%，放线菌在37% ~51%。2 种之间差异超过10%，肯定不是同一个种 微生物分类方法4 遗传学分类方法 DNA中G+C含量百分比分析 细菌含量变化范围在25%~75%，放线菌在37% ~51%。2 种之间差异超过10%，肯定不是同一个种 DNA-DNA杂交 测定杂合的百分数，如同一种，应为100% DNA-rRNA杂交 16SrRNA寡核苷酸的序列分析 分析后作出相似性图，关系近的集中到一起，关系远的在图上占据不同的位置

分离菌株16S rRNA基因的分离 从平板中直接挑取一环分离菌株细胞, 加入100μL无菌重蒸H2O中, 旋涡混匀后, 沸水浴2min, 12 000r min-1离心5min, 上清液中即含16S rRNA基因，可直接用于PCR扩增。 分离菌株16S rRNA 基因的PCR扩增和序列测定的一般步骤为：16S rRNA基因的PCR引物：5‘-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3’；5‘-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3’。扩增反应体积50L，反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共进行29个循环，PCR反应在PTC-200型热循环仪上进行。取5L反应液在10g L-1的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 PCR产物测序可由专门技术公司完成。

系统发育树的构建 测序得到分离菌株16S rDNA部分序列，此序列一般以*.f.seq形式保存，可以用写字板或Editsequence软件打开，将所得序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast )。 具体步骤如下：点击网站中Nucleotide BLAST下Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn]选项，将测序所得序列粘贴在“search”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“blast”，然后点击“format”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断16S rDNA鉴定结果。

遗传距离矩阵 遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用DNAStar软件包中的MegAlign程序计算样本间的遗传距离。由GenBank中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入Clustalx1.8程序进行DNA同源序列排列，并经人工仔细核查。 在此基础上，序列输入Phylip3.6软件包，以简约法构建系统发育树。使用Kimura 2-parameter法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（Bootstrap）500次重复检测，DNA序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。