二相代谢酶诱导剂PYDDT激活Keap1-Nrf2通路的机制研究 浙江大学药学院 张潇雨, 马忠俊 报告人：张潇雨 Email: zhangxy_zju@hotmail.com -1-
研究背景 肿瘤的发展过程包括起始期、促进期和发展期，这一过程大概经历10~40年的时间。《中国癌症预防与控制规划纲要》（2004-2010）的指导原则中第一条就明确指出，“癌症防治必须坚持‘预防为主’”。肿瘤的预防措施包括一级预防和二级预防。一级预防是指消除致癌因素的影响、采取能降低致癌风险的生活方式；二级预防即化学预防，系采用无毒的天然或合成物质，通过逆转、阻断或延迟癌症发生的各个阶段降低恶性肿瘤发生的危险。 二相代谢酶诱导剂属于一类癌症化学预防剂，它通过升高具有清除自由基和亲电试剂作用的二相代谢酶保护细胞避免致癌作用。二相代谢酶家族包括NAD(P)H: 醌氧化还原酶（NQO1）、单加氧酶（OH-1）以及谷胱甘肽转移酶（GST）等。 异硫氰酸酯类 （isothiocyanates） 卷心菜 二苯乙烯类 （stilbenes） 红酒 -2-
研究背景 二相代谢酶的表达依赖于ARE基因的激活，这个过程是通过激活核转录因子Nrf2实现的。在基本的生理状态下，转录因子Nrf2与Keap1结合存在于细胞质中并通过Keap1-Cul3-Rbx依赖的泛素化过程保持平衡。在氧化应激条件下，Nrf2可与Keap1解离从而使其泛素化减少，从而更多的进入细胞核，激活ARE基因并诱导二相代谢酶的表达。 PYDDT为一种从传统中药禹州漏芦中分离得到的炔醇取代噻吩类化合物。中国药典（2005年版）：漏芦具有清热解毒、排脓止血、消脓止血的功效。 图1 Keap1-Nrf2通路示意图 图2 PYDDT的化学结构 -3-
材料与方法 结晶紫法确定IC50值 NQO1诱导测试法确定CD值 Western Blotting考察蛋白表达情况 LC-MS&NMR技术考察PYDDT与GSH结合情况 免疫荧光考察Nrf2入核及总蛋白谷胱甘肽化修饰情况 免疫沉淀考察Keap1谷胱甘肽化修饰情况 DTNB法测定细胞内GSH含量 流式细胞术测定细胞内ROS水平 分子对接模拟谷胱甘肽化修饰对蛋白相互作用的影响 -4-
研究结果 1. PYDDT具有很强的二相代谢酶诱导作用，且该作用是通过激活Keap1-Nrf2通路实现的； -5-
研究结果 2. PYDDT在体外实验中能够与GSH强烈结合，在细胞内可在4小时内迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平； -6-
研究结果 2. PYDDT在体外实验中能够与GSH强烈结合，在细胞内可在4小时内迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平； 23% 图5 PYDDT在细胞内可迅速降低细胞内GSH含量，并上调ROS水平 -7-
研究结果 3. PYDDT激活Nrf2及Nrf2介导的NQO1表达均可被外源性GSH逆转； 图6 外源性GSH对PYDDT激活Keap1-Nrf2通路及诱导二相代谢酶的影响 -8-
研究结果 4. PYDDT所导致的细胞内GSH/GSSG比例的下降可引起细胞内蛋白的广泛谷胱甘肽化，这其中也包括Keap1； 图7 “Thiol-disulfide exchange”理论 -9-
研究结果 5. 利用计算机分子对接，当Keap1的Cys434被谷胱甘肽化修饰后，Keap1与Nrf2的相互作用显著减弱； Keap1和GSSG在体外孵育反应，经过LC-MS分析，有七个半胱氨酸残基发生谷胱甘肽化修饰 Chem. Res. Toxicol. 2008, 21, 2051–2060. 强氢键干扰 图9 Keap1的Cys434残基被谷胱甘肽化修饰后对Keap1-Nrf2复合物的影响 -10-
结论与讨论 1. PYDDY为一类结构新颖的迈克尔受体小分子，在低细胞毒浓度下即具有很强的二相代谢酶诱导作用，说明PYDDT可作为一种有效的肿瘤化学预防剂进行更加深入的研究； 图10 PYDDT激活Keap1-Nrf2通路的可能机制 图11 PYDDT的其它潜在分子靶点 -11-
结论与讨论 2. 传统上认为迈克尔受体小分子（包括异硫氰酸酯类、查尔酮类、丹参酮类等）发挥活性作用的方式为直接与蛋白半胱氨酸残基的巯基结合。虽然很多体外实验证明了该假设，但在细胞内的情况目前尚无明确阐述。我们在一定的实验基础上提出一种全新的假设：即该类化合物可能并非与蛋白质巯基结合而更倾向于首先与细胞内GSH结合，这种GSH的迅速下调可导致蛋白质的不同修饰（包括本研究中的谷胱甘肽化），从而发挥该类化合物的生物活性； -12-
（Michael addition acceptors） 结论与讨论 迈克尔受体小分子 （Michael addition acceptors） 1、激活Keap1-Nrf2通路； 2、抑制NF-κB; 3、诱导凋亡； 4、细胞周期阻滞。 经典推测模型 为何各类迈克尔受体小分子又体现出不同的分子靶向性？ 细胞内表现？ 1、改变细胞内GSH的能力和速率不同？ 2、残留靶向性？ -13-
致谢 感谢浙江大学药学院药物信息学研究所马忠俊老师及其课题组全体同学！ -14-
Thank You ! -15-