第三章 体细胞离体培养及杂交 植物原生质体制备和检测 第三章 体细胞离体培养及杂交 植物原生质体制备和检测 原生质体：protoplast 指除去细胞壁后裸露的有生活力的原生质团。 原生质体没有细胞壁，所以易于摄取外来遗传物质，可以进行有关遗传操作和细胞融合；同时，原生质体具有活细胞的全能性，可以生长发育成完整植株。 原生质体一词来源于原生质（protoplasm）。原生质指组成细胞的有生命物质的总称，是物质的概念。原生质体是组成细胞的一个形态结构单位。在细胞学历史上，“细胞”（cell）一词是由Hooke首先提出的。后来发现了原生质，对细胞的认识与Hooke时期不同了，1880年Hanstein提出“原生质体”一词。由于细胞一词的出现较原生质体早，故沿用至今。
植物原生质体制备和检测 1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。 1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。 直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。
植物原生质体制备和检测 原生质体的分离： 原生质体来源: 植物叶片：取材容易，较容易用酶解法分离。 植物根尖组织：由各种植物的种子萌发后取得。 植物花粉：特殊材料，产生单倍体原生质体。 愈伤组织、悬浮培养细胞：细胞壁容易解离。 总之，植物体的幼嫩备份是制备原生质体的理想材料。
植物原生质体制备和检测 原生质体的分离方法： 1.机械分离法：利用高渗溶液使细胞发生质壁分 离，再借助机械剪切或磨损释放原生质体。1892年，Klereker。 分离效率低，获得原生质体少，很少使用。 2.酶解法：在适宜条件下，利用酶的作用降解细 胞壁，从而获取原生质体的方法。 效率较高，是目前主要采用的原生质体分离方法。
植物原生质体制备和检测 纤维素酶，绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C1，分解天然纤维素；一般使用浓度为1%-3%。 酶解法常用的酶： 纤维素酶，绿色木霉中提取的一种复合酶制剂，主要含有纤维素酶C1，分解天然纤维素；一般使用浓度为1%-3%。 半纤维素酶可以降解半纤维素；使用浓度为0.2%-0.5%。 果胶酶降解果胶质，根霉中提取的。常用浓度为0.1%-1%。 此外，还有崩溃酶，蜗牛酶，胼胝质酶等。 植物细胞壁主要有纤维素，半纤维素，果胶质和少量蛋白组成。纤维素占细胞壁干重的25％至50％；半纤维素平均约占细胞壁干重的53％左右；果胶一般占细胞壁的5％。 崩溃酶是具有纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和木糖酶等多种酶活性的粗制酶，酶解细胞壁能力比较强，用于一些细胞壁很难降解的植物；蜗牛酶是蜗牛胃液中分离的酶粗制剂，可以降解木质素，用于分离花粉和小孢子的原生质体。
植物原生质体制备和检测 原生质体的纯化方法： 通过机械法或者酶解法分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体。 (1) 沉降法 (2) 漂浮法 (3) 界面法。
植物原生质体制备和检测 (1) 沉降法： 结合过滤和离心方法，利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先用40-100μm的筛网进行过滤以除去大的细胞团等，然后低速离心（900-4500 r/min)，使纯净完整的原生质体沉积于离心管底部，重复2-3次。 比较简单，方便收集；但不能除尽一些完整的细胞，容易引起原生质的破碎。
植物原生质体制备和检测 (2) 漂浮法： 采用比原生质体比重大的高渗溶液，如加入蔗糖的高渗溶液，然后低速离心，使细胞碎片沉到底部，而原生质体则漂浮在溶液表面，重复操作2-3次，即可纯化原生质体。 可以得到较为纯净、完整的原生质体，避免了纯化过程中原生质体的破损；但完好的原生质体数量较少，获得率较低。
植物原生质体制备和检测 (3) 界面法： 采用两种比重不同的溶液，通过离心使原生质体处于两液相的界面之间，而细胞碎片和破碎的原生质体则沉在管底。 常用的有PEG-Ficoll，甘露醇-Ficoll，蔗糖-甘露醇混合系统。 可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。 Ficoll：聚蔗糖。
植物原生质体制备和检测 原生质体的活力检测： （1）形态识别： 形态上完整，含有饱满的细胞质，颜色新鲜的原生质体即为存活的。进一步的，把原生质体放入低渗透溶液中，在显微镜下观察。完整的原生质体，因为没有细胞壁，这样在胀破后留下的残迹应该是无形的；带有部分细胞壁的原生质体，破碎后留下的残迹仍保持半圆形的细胞壁。 （2）染色法识别：
植物原生质体制备和检测 二乙酸荧光素（FDA）法：FDA本来没有荧光，当其进入细胞后被脂酶分解为具有荧光的极性物质，不能透过质膜而留在细胞内。在紫外光照射下产生绿色荧光，因此能发出荧光的是具有活性的原生质体。 酚藏花红染料法：具有活力的原生质体不能吸收染料而显示白色；无活力的破损的原生质体吸收染料显红色。 伊凡蓝染色法：有活力的细胞不能吸收染料不显色；而破损的细胞则能吸收染料显蓝色。