基因重组和基因工程 Genetic recombination and Genetic Engineering 第14章 基因重组和基因工程 Genetic recombination and Genetic Engineering

第一节 基因重组

一、自然界DNA重组和基因转移是经常发生的 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 转 座 (transposition) 同源重组 (homologous recombination) 位点特异的重组(site-specific recombination)

2.同源重组是最基本的DNA重组方式 发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologous recombination)，又称基本重组（general recombination）。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。

3.细菌的基因转移与重组主要有三种方式 （1）接合作用(conjugation) ：当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。 （2）转化作用(transformation)：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 。 （3）转导作用(transduction) ：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。

4.位点特异重组，即特异位点间发生的整合 5.转座重组 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 5.转座重组 大多数基因在基因组内的位置是固定的，但有些基因可以从一个位置移动到另一位置。这些可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。 由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。 转座子(transposons) ——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

第二节 重组DNA技术 又称DNA克隆或分子克隆

㈠.相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 ㈡.基本原理 ㈢.重组DNA技术在医学中的应用及前景

㈠.重组DNA技术相关概念 1. DNA克隆 ⑴克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 ⑵获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。 ⑶水平：分子克隆(molecular clone)（即DNA 克隆）；细胞克隆；个体克隆（动物或植物）　 ⑷DNA克隆:应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。

2.工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶

⑴重组DNA技术中常用的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3´末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基

⑵限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ①概念：限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G CCTAG GATCC G + ②分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型） ③作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。

Hin dⅢ ③命名： ④Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) GGATCC CCTAGG Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶 属 系 株 序 第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。 ④Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) GGATCC CCTAGG

+ + ⑤切割方式及切割结果： 交错切割 对称切割 粘端切口 平端切口 HindⅡ Bam HⅠ GTCGAC CAGCTG GGATCC 5’突出末端 （ 5’- cohesive end ） 3’突出末端 （ 3’- overhang tail） HindⅡ Bam HⅠ GTCGAC CAGCTG GGATCC CCTAGG 切割的化学本质：磷酸二酯键的断裂, 形成含5’— P和3’—OH 末端的两个DNA片段。 对一特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则切点数多，产生的片段小。 GTC CAG GAC CTG + GATCC G G CCTAG + 粘端切口 平端切口

+ + ⑥同功异源酶： 来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。 Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G BstⅠ GATCC G GGATCC CCTAGG G CCTAG +

⑦同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA A TCTAG GATCT A GATCC G + G CCTAG +

限制性内切核酸酶 名 称 识别序列及切割位点 名 称 识别序列及切割点 切割后产生５’突出末端: BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’ 名　　称　　 　识别序列及切割位点 名　　称　　　　　识别序列及切割点 切割后产生５’突出末端: BamHⅠ 5’…G▼GATCC...3’ Bgl Ⅱ 5’…A▼GATCT...3’ EcoR Ⅰ 5’…G▼AATTC...3’ Hind Ⅲ 5’…A▼AGCTT...3’ Hpa Ⅱ 5’…C▼CGG...3’ Mbo Ⅰ 5’…▼GATC...3’ Nde Ⅰ 5’…GA▼TATG...3’ 切割后产生3’突出末端: Apa Ⅰ 5’…GGGCC▼C...3’ Hae Ⅱ 5’…PuGCGC▼Py...3’ Kpn Ⅰ 5’…GGTAC▼C...3’ Pst Ⅰ 5’…CTGCA▼G...3’ Sph Ⅰ 5’…GCATG▼C...3’ 切割后产生平末端: Alu Ⅰ 5’…AG▼CT...3’ EcoR Ⅴ 5’…GAT▼ATC...3’ Hae Ⅲ 5’…GG▼CC...3’ Pvu Ⅱ 5’…CAG▼CTG...3’ Sma Ⅰ 5’…CCC▼GGG...3’

3.目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。

⑴定义:为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 4.基因载体 ⑴定义:为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。 ⑵载体的选择标准： 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。

⑶载体的分类：按功能分类 ①克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。 ②表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。

①克隆载体 具备条件： a 必须是一个复制子，能在受体细胞中复制 复制起点 Ori；复制区；复制终点 term b 带有抗药性基因 功能：用来克隆和扩增DNA片段（目的基因）的载体。 具备条件： a 必须是一个复制子，能在受体细胞中复制 复制起点 Ori；复制区；复制终点 term b 带有抗药性基因 Tet r：编码膜蛋白，阻止Tet进入细胞 Amp r：β-内酰胺环水解酶 Kan r： Kan～ P , neo～ p Cam r：氯霉素乙酰基转移酶 c 具有多克隆位点（multiple cloning sits，MCS ） 载体上含有的一个人工合成的DNA片段，其上含有数个单一酶切位点，是外源DNA的插入部位，是载体中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成。这些位点在载体上都是单一位点。 d 可导入受体细胞

②表达载体 功能：在受体细胞中表达外源基因的载体 结构：克隆载体 + 表达构件 — 原核生物表达 真核生物表达 具备条件： ori 结构：克隆载体 + 表达构件 — 原核生物表达 真核生物表达 具备条件： ori ampr 基础上加转录和翻译相关元件 MCS

⑷载体的分类：按来源分类 ①质粒DNA ②噬菌体DNA ③病毒DNA ④其他

①质粒 (plasmid) 特点: 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。

②噬菌体(phage) λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆） M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列

粘性质粒(cosmid) ①含质粒的ampr 或 tetr 、Ori成分，可在大肠杆菌中 复制； 由λ噬菌体的cos区与质粒DNA构建而成。 特点： ①含质粒的ampr 或 tetr 、Ori成分，可在大肠杆菌中 复制； ②含噬菌体的cos区，可在体外进行包装； 含1个或多个酶切位点； ③本身分子量小（6.5 kb 左右），可容纳40kb的DNA片段； ④非重组体太小不能包装，只包装重组体，便于筛选。

③病毒载体 如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒等。可进一步分为： 整合性载体：外源基因通过这种载体与宿主细胞的染色体整合。如pSV系列载体。 游离型载体：外源基因与这种载体重组后，以病毒颗粒形式在宿主细胞内自行复制或在辅助病毒存在下进行复制。如痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒和逆转录病毒等。

④其他 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC)

㈡.重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达

以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程

（1）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)

1.化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。

2.从基因组DNA文库获取目的基因 组织或细胞染色体DNA 限制性内切酶 基因片断 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 克隆载体 重组DNA分子 受体菌 含重组分子的转化菌

3.从cDNA文库获取目的基因 mRNA 反转录酶 cDNA 复制 双链cDNA 载体 DNA聚合酶Ⅰ 重组DNA分子 受体菌 cDNA文库 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制

4.PCR或RT-PCR 获取目的基因 根据目的基因的核苷酸序列设计一对引物以基因组DNA为模板经PCR扩增目的基因。 以mRNA或RNA为模板经RT-PCR扩增目的基因。

（2）克隆载体的选择和构建 目的不同，操作基因的性质不同，载体的选择和改建方法也不同。

获得载体后，用适当的限制酶切割载体DNA分子，获得线形分子。尽量用与消化目的基因时相同的酶来切割载体，以便获得相同的粘末端，便于连接。 载体的选择主要考虑以下5个条件 1.有足够容纳目的基因的幅度 根据克隆外源DNA片段的大小选择合适的 载体 2.构建DNA重组体的目的 克隆选克隆载体，表达选表达载体 3.载体MSC中的酶切位点 根据克隆外源DNA的酶切位点选择具有相同酶切位点的载体 4.根据受体细胞的类型确定表达载体的类型 5.载体克隆位点的阅读框要与目的基因的阅读框匹配 获得载体后，用适当的限制酶切割载体DNA分子，获得线形分子。尽量用与消化目的基因时相同的酶来切割载体，以便获得相同的粘末端，便于连接。

（3）外源基因与载体的连接 粘性末端连接 平端连接 同聚物加尾连接 人工接头(linker)连接

粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接

+ 同一限制酶切位点连接 GGATCC 重组体 载体自连 目的基因自连 Bam HⅠ切割反应 CCTAGG GATCC G CCTAG G 载体DNA用Bam HⅠ切割 T4 DNA连接酶 15ºC 重组体 载体自连 目的基因自连

配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ T4 DNA连接酶 15ºC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。

平端连接 适用于： 限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端

目的基因 载体 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15ºC 重组体 载体自连 目的基因 自连

同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。

目的基因 载体DNA 重组体 T4 DNA连接酶 15ºC 5´ 3´ 限制酶或机械剪切 限制酶 3´ T(T)nT T(T)nT 3´ 3´ A(A)nA A(A)nA 3´ λ-核酸外切酶 末端转移酶 + dATP + dTTP T(T)nT A(A)nA A(A)nA T(T)nT T4 DNA连接酶 15ºC 重组体

人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。

Eco RⅠ 人工接头及其应用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5´- 3´- Eco RⅠ

（4）重组DNA导入受体菌 受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) 导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)

受体菌条件： 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent)

受体细胞应具备下列条件: 1.安全宿主菌（或宿主细胞）：在人肠道几无存活或存活率极低。 2.限制酶缺陷型：外源DNA进入受体菌不被降解 3.重组缺陷型：保证外源DNA不与细菌基因组DNA重组，独立存在 4.能发展成感受态细胞的菌株 感受态：是受体菌能接受外源DNA能力的一种生理状态 感受态细胞：指经过一定方法处理后具备接受外源DNA能力的细胞

导入方式： 转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)

定义： 将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 1. 转化（transformation） 定义： 将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程。 过程：细胞—低温CaCl2处理—感受态细胞—加重组DNA—42℃热休克—重组体吸入细胞—复苏—涂板（含抗生素）—筛选转化菌落。

2. 感染（fection） 以噬菌体、粘粒和真核病毒为载体的重组DNA分子，体外经包装成为具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染相应的细胞，并在其中扩增。此过程又叫转导（transduction）。 感染效率远远高于转化效率

3. 转染（transfection） 真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

（5）重组体的筛选 1. 直接选择法 (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2. 免疫学方法 如免疫化学方法及酶免检测分析等

抗药性标记选择 (插入失活法) 适用于含>2个的抗性标记的质粒。例如pBR322，含Tetr（BamHI位点）和Ampr基因，外源DNA插入，使Tetr灭活。 分别用含Ampr 和Tetr的平皿同时筛选，可鉴定出重组子。

某些质粒（如PUC系列），含有大肠杆菌的lacZ基因片段，在该基因区又有MCS，这些质粒将导入 lacZ- 的宿主菌中表达。 如果无外源基因插入：则质粒lacZ基因正常表达和宿主菌的lacZ基因互补，产生有活性的β –半乳糖苷酶，经IPTG诱导后，分解X-gal底物，产生blue clony。 如果有外源基因插入：则质粒编码的lacZ基因失活、菌体不可能互补产生β –半乳糖苷酶，产生white clony。

重组DNA技术操作的主要步骤 载体 目的基因（外源基因） 开环载体DNA 目的基因 重组体 带重组体的宿主 限制酶消化 连接酶 转化 质粒 噬菌体 病毒 目的基因（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交

小结 重组DNA技术操作过程可形象归纳为： 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体细胞 筛 筛选重组体

（6）克隆基因的表达 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化

1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足： 不宜表达真核基因组DNA； 不能加工表达的真核蛋白质； 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body) ； 很难表达大量可溶性蛋白。

大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌

2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞） 优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射

㈢重组DNA技术在医学 中的应用及前景

1.疾病基因的发现与克隆 2.生物制药 3.基因诊断与治疗 4.遗传疾病的预防 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。 2.生物制药 利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。 3.基因诊断与治疗 4.遗传疾病的预防 产前诊断；携带者测试；症候前诊断；遗传病易感性

基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。又称DNA诊断 。 标准： 能正确扩增靶基因； 能准确区分单个碱基的差别； 本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定; 便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。

方式： 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)

克隆技术的应用前景 1.改良动物品种 2.挽救濒临灭绝的物种 3.培植人体皮肤 4.研制名贵药品 5.培育人体器官

课后复习题 一、名词解释 1. cDNA文库 2.粘性末段 3.多克隆位点 4.表达载体 5. 转染 6. 质粒 四、问答题 4.表达载体 5. 转染 6. 质粒 四、问答题 1.简述目前获取目的基因的主要途径和来源。 2.简述基因克隆的基本过程。 3.简述外源基因与载体的主要连接方式。 4.写出真核表达系统中常用于细胞转染的方法。 5.基因工程载体的选择标准主要有哪些？