Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI ) 电化学发光免疫分析法 Electro-Chemiluminescence Immunoassay (ECLI )

免疫分析法 发光和化学发光 化学发光免疫分析法 电化学发光 电化学发光免疫分析法

免疫分析 基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段； 免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。 常用的标记物包括荧光素、酶和放射性核素等，用这3种标记物进行标记的免疫检测技术被称为3大免疫标记技术。

免疫学检测历史演进 放射免疫检测（兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院）； 酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）； 以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。 我国放射免疫分析法有很高的灵敏度，但存在着放射性防护和同位素污染等问题。

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发光现象 生物发光和化学发光是自然界中一种普遍现象。

萤火虫发光

深海鱼发光

发光分类 生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。 化学发光 光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。 生物发光：反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回复到基态时多余的能量以光子形式放出。 化学发光 一种物质由电子激发态回复到基态时，释放出的能量表现为光的发射。

化学发光 Chemiluminescence (CL) 化学发光是指在某些特殊的化学反应中，反应的中间体或产物由于吸收了反应释放的化学能而处于电子激发态，当其回到基态时伴随产生的光辐射现象。

化学发光反应包括两个关键步骤，即化学激发和发光。 化学发光的物质有两种能态，即基态和激发态，前者能级低后者能级很高，一般地说在激发态时分子有很高并且不稳定的能量，它们很容易释放能量重新回到基态，当能量以光子形式释放时，我们就看到了生物发光。 化学发光反应能级图

化学发光分析 根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，称为化学发光分析。

化学发光分析优点 化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度， 并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。 化学发光技术是近二、三十年来发展起来的一种测定方式

化学发光分析缺点 虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。 因此，如同RIA、FIA等一样利用免疫反应的特异性和化学发光本身的信号特异性形成了化学发光免疫测定（CLIA）技术。

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化学发光免疫分析 chemiluminescence immunoassay（ CLIA） 这种方法兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。 CLIA是继酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）和时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后发展的一项新兴测定技术。

化学发光免疫分析（ CLIA）分类 按分离方法不同分 微粒子化学发光免疫测定 磁颗粒化学发光免疫测定 微粒子化学发光免疫分析（ECIA） 也是一种酶免疫分析，用磁珠作为固相载体，增加反应体积和分离效率。标记的酶多为ALP。

化学发光免疫分析（ CLIA）分类 按发光剂不同分为 发光酶免疫测定（chemiluminescence enzyme immunoasssay， CLEIA ） 化学发光免疫测定技术 （chemiluminescence immunoassay， CLIA ） 电化学发光免疫测定技术（electro－chemiluminescence immunoassay， ECLI ） 化学发光酶免疫分析（CLEIA） 以催化反应的酶为标记物，抗原抗体结合后，其中的酶可对发光体系产生催化作用，产生发光效应。发光信号与抗原抗体的量成正比。多用的发光体系是HRP-鲁米诺。 化学发光免疫分析（CLIA） 是一种用发光剂直接标记抗体的一类免疫分析法，用来标记的发光物必须能参与发光反应、标记和偶联后能稳定、理化性质和免疫特性不改变，多用吖啶酯类和苯酚类化合物。

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电致化学发光（ECL) 电致化学发光 (ECL) 是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。 它是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程。

电致化学发光（ECL) ECL与CL的差异在于ECL是电启动发光反应，而CL是通过化合物混合启动发光反应。因此ECL反应易精确控制，具有灵活性。

电化学发光剂 定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。 特点 反应在电极进行 化学发光剂：三联毗啶钌 电子供体为：三丙胺（TPA） 它如同酶免疫测定中的底物， 配入缓冲液中， 是ECLI反应中的电子供体。

三联毗啶钌分子结构图

三联吡啶钌 （ [Ru(bpy)3]2+ ）特点 ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作为标记物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羟基琥珀酸胺酯（NHS） ，该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。

三联吡啶钌（ [Ru(bpy)3]2+ ）特点 [Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性； [Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小 ，即便小分子的核酸也能标记，使检测的菜单大大丰富，更重要的是为其检测菜单的开发前景提供了广阔空间。

电化学发光原理图 激发态 发光剂 [Ru(bpy)3]2+和电子供体TPA在阳极表面可同时各失去一个电子而发生氧化反应，使二价的[Ru(bpy)3]2+被氧化成三价，后者是一种强氧化剂；另一方面，TPA 被氧化成阳离子自由基TPA+●，后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA●，这是一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的[Ru(bpy)3]3+，使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化成二丙胺和丙醛。激发态的[Ru(bpy)3]2+通过荧光机制衰减，发射出一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3]2+。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测抗原的含量。 发光标记物不被消耗，可以循环发光，这一过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，使光信号得以增强。 不稳定 基态

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电化学发光免疫分析 (Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI) ECLI是继EIA、RIA、FIA、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA）之后的新一代标记免疫测定技术； ECLI是电化学发光(ECL)和免疫测定相结合的产物； ECLI是目前最先进的标记免疫测定技术之一。 酶免技术（EIA）、放免技术（RIA）、荧光免疫技术（FIA）、时间分辨荧光免疫技术（TRFIA） 一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光二个过程,其中应用了“亲和素-生物素”放大系统，使检测的灵敏度大大提高

ECLI原理 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。 用抗原或抗体包被磁颗粒,与标本中相应抗原或抗体和酶标的抗体或抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过磁场将结合酶标记物IC和游离酶标记物进行分离的技术。

ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成） 结合了活化的三联吡啶钌衍生物即[Ru(bpy)3]2+ + N羟基琥珀酰胺酯（NHS）的TSH抗体和结合了生物素的TSH抗体与待测血清同时加入一个反应杯中孵育9分钟。 三联吡啶钌标记抗体和生物素标记抗体与待测标本 同时加入一个反应杯中孵育反应 ECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）

ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合） 将被链霉亲和素包被的磁珠加入反应杯中，再次孵育9分钟，使生物素通过与亲和素的结合将磁珠、TSH抗体连接为一体，形成双抗体夹心法。将链霉亲和素（SA）包被磁珠加入反应杯中，再次孵育，使生物素（B）通过与亲和素（A）的结合，将磁珠、Ab连接为一体，形成双Ab夹心法。 链霉亲和素包被、生物素化抗体、以增大抗体结合量，达到放大效果。 ECLIA检测流程图二 （生物素与亲和素结合）

双抗体夹心法 ECLIA体系结构图

ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面） 蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+－抗体－抗原－抗体－磁珠复合体吸入流动测量室，此时，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的TSH抗体（与生物素结合的和与[Ru(bpy)3]2+结合的抗体）也被吸出测量室。 蠕动泵将形成的 [Ru(bpy)3]2+-Ab-Ag-Ab-B-SA-磁珠复合体吸入流动测量室，磁珠被工作电极下面的磁铁吸附于电极表面。同时，游离的Ab也被吸出测量室。 ECLIA检测流程图三 （磁珠吸引吸附于电极表面）

ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应） 蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系,故可测出待测Ag的含量。紧接着，蠕动泵加入含三丙胺（TPA）的缓冲液，同时电极加电压，启动ECL反应过程。 ECLIA检测流程图四 （电极充电启动电化学反应）

终止电压，移开磁珠，加入清洗液冲洗流动测量室，准备下一个样品测定。 ECLIA检测流程图五 （撤消磁场冲洗磁珠）

方法评价 采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8 μm的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快；

方法评价 “链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高； 链霉亲和素（streptoavidin，SA）和生物素（biotin，B）一分子SA可与4分子B相结合。在ELECSYS的试剂中，SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上，形成通用的能与B结合的固相载体。另一试剂为与经活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时，抗原或抗体即包被在磁性微粒上。

方法评价 利用氧化铁的磁性，使用电磁场分离结合态和游离态，方便迅速，实现了精确的全自动化； 标记物的再循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定。

ELIA优越性 高度敏感，可达pg／ml或pmol水平； 特异性强，重复性好，CV＜5％。 测定范围宽，可达7个数量级。 试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。 操作简单，耗时短，易于自动化。 在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。

临床应用 激素 肿瘤标记物 内分泌功能 传染性疾病 其它 如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。 甲状腺激素，甲肝，乙肝，已成为一种重要的非同位素标记免疫分析方法，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。

试剂不开放、检测成本高, 成为电化学发光技术应用的最大障碍

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