第十二章核酸的生物合成 ◆第一节 DNA复制 的一般规律 ◆第二节 与DNA复制有关的酶和蛋白质因子 ◆第三节 原核生物DNA复制的分子机制 ◆第五节 反转录（RNA指导的DNA聚合） ◆第六节 DNA的修复 ◆第七节 转录与“加工” ◆第八节 重组DNA技术

第十二章 核酸的生物合成 第一节 DNA复制 的一般规律

由Watson和Crick的DNA双链结构所设想的三种DNA复制模型图

二、证明DNA复制是半保留的方式的Meselson和Stahl实验

三、DNA复制是单向或双向进行 E.coli染色体的双向复制

复制叉前进的方向

四、复制是半不连续的 DNA复制的半不连续模型图 返回

第二节 与DNA复制有关的酶和蛋白质因子 一、DNA聚合酶（DNA复制酶） E.coli DNA聚合酶性质

1、E.coli DNA聚合酶Ⅰ 由单一多肽链构成的E.ColiDNA聚合酶Ⅰ有三个活性位点

Arthur Kornberg won the 1959 Nobel Prize in Medicine for his discovery of the mechanism in the biological synthesis of deoxyribonucleic acid (before Watson and Crick won theirs!)

（1）DNA聚合酶Ⅰ催化的DNA链延伸反应(5，—3，的聚合活性）

（2）、DNAⅠ聚合酶具有校正与编辑属性（E.coli ）

（3）DNA聚合酶Ⅰ的3’-5’外切核酸酶活性从生长的DNA链3’端切除错配碱基

（4） DNA聚合酶Ⅰ的切除与修复模式

（5）、聚合过程需要模板（DNA） （6）、聚合过程需要引物（RNA）

2、大肠杆菌的三种DNA聚合酶 （1）、DNA聚合酶Ⅰ （2）、 DNA聚合酶Ⅱ （3）、 DNA聚合酶Ⅲ

3、大肠杆菌DNA聚合酶的比较 项 目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ 结构基因 polA polB polC 亚 基 数 1 ≥4 ≥10 项 目 Ⅰ　　　　Ⅱ　　　Ⅲ 结构基因 polA polB polC 亚 基 数 1 ≥4　　≥10 分 子 量 103000 88000 830000 3-5外切 有 有 有 活性 5-3外切 有 无 无

多聚化速度 16-20 40 250-1000 （核甘酸/秒） 连续性（解离 前补加核甘酸 3-200 1500 ≥500000 数）

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ的亚基 亚基 全酶中的亚基数 分子量 α 2 13200 ε 2 27000 θ 2 10000 τ 2 71000 亚基 全酶中的亚基数 分子量 α 2 13200 ε 2 27000 θ　　　　 2 10000 τ　　　　　2 71000 γ　　　　　2 52000 δ　　　　　1 35000

δ 1 33000 χ 1 15000 ψ 1 12000 β 4 37000

基因 亚基的功能 polC(dnaE) 多聚化活性 dnaQ(mutD) 3-5外切酶 核心聚合酶 holE 活性(校正) dnaX 稳定模板结合 核心酶二聚化 dnaX* holA holB “钳”安置复合物 holC holD dnaN 增加复制连续性DNA的“钳”

4、DNA连接酶的作用机理

5.E.coli DNA复制中所涉及的蛋白质 蛋白质 亚基数目 功能 Dna A 1 识别起点序列,在起点特异性位置解开双链 蛋白质 亚基数目 功能 Dna A 1 识别起点序列,在起点特异性位置解开双链 Dna B 6 解开DNA双链 Dna C 1 帮助Dna B 结合于起点 HU 2 类组蛋白,DNA结合蛋白,促进起始 引物合成酶(Dna G) 1 合成RNA引物 单链结合蛋白(SSB) 4 结合DNA单链 RNA聚合酶 5 促进Dna A 的活性 DNA旋转酶(拓扑酶Ⅱ)4 释放DNA解链过程中产生的扭曲张力 Dam甲基化酶 1 使起点GATC序列的腺嘌呤甲基化

E.coli DNA复制中所涉及的蛋白质 返回

原核生物DNA的复制包括： 1、起始 2、延伸 3、终止

一、DNA复制的起始 1、复制的起点 大肠杆菌的复制起点为oriC，是由245个碱基对组成，这些序列在大多数细菌中是高度保守的，关键序列是3个13bp和4个bp的重复序列。 3个13bp串联重复序列 DnaA蛋白结合的4个9bp顺序 交感顺序 交感顺序

2、有9个蛋白和酶参与复制的起始 DnaA蛋白 识别原点顺序在特定位点上打开DNA双链 DnaB蛋白 DNA解螺旋 DnaC蛋白 帮助DnaB蛋白 与原点结合 HU 刺激复制起始 引物酶DnaG蛋白 合成RNA引物 SSB 结合单链DNA RNA聚合酶 促进DnaA蛋白激活 DNA旋转酶 释放解螺旋时产生的张力 Dam甲基化酶 甲基化原点的5GATC序列

A、20个各带1个ATP的DnaA蛋白 结合于 9bp顺序，使DNA围绕着复合物卷成一圈 起始复合物 B、三个富含A=T的序列13bp重复序列被变性 开放复合物 C、在DnaC蛋白 的帮助下DnaB蛋白进一步使DNA解螺旋，以备引物和DNA的合成 预引复合物 引发复制

3、SSB 结合单链DNA SSB 结合单链DNA，防止分开的DNA单链重新缔合。防止分开的DNA单链被DNA酶水解。

4、 DNA旋转酶释放解螺旋时产生的张力

5、形成复制叉 在原点处通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过程形成复制叉。

二、DNA新链的延伸

1、引发—RNA 引物的合成 在引发体（引物酶、DnaG的作用下）在原点处合成一小段RNA引物（10-60个碱基），然后由DNA聚合酶Ⅲ合成DNA链。前导链合成一个引物，滞后链断续合成多个引物。

2、DNA新链的延伸 新链延伸的速度是1000核甘酸/秒

3、引物的消除和缺口的补充

4、DNA片段的连接

三、DNA复制的终止过程 1、终止区域 大肠杆菌DNA上存在多重拷贝的 Ter顺序,这种Ter顺序长20bp,包括TerA、 TerB、 TerC、 TerD、 TerF 和TerG，它们在DNA上排列以创造出一种“陷阱”,阻止复制叉的移动。防止过分复制。

三、DNA复制的终止过程

顺时针复制叉 逆时针复制叉 逆时针复制 叉陷阱 顺时针复制叉陷阱 11

2、当任意一个复制叉碰到一个功能性Tes-Tur复合物时，就停止。而另一个复制叉碰到第一个被阻止的复制叉时也停止前进。这些大复合物中间的几百个核甘酸对以一种未知的机制被复制。完成两个环行染色体的拓扑学联系。分开这种连环需要拓扑异构酶Ⅳ。 返回

第四节、真核生物DNA的复制 一、自体复制顺序（ARS、原点、复制子）真核生物（酵母）ARS约有150个bp，含有几个保守序列，在单倍体酵母细胞的17条染色体中有400个ARS因子，这表明在真核生物DNA中有多个复制的起点。真核生物DNA的复制的起始还需要一个原点识别复合物（ORC），受控制真核生物细胞周期的蛋白质的调控。

二、存在复制叉 真核生物DNA复制过程中也出现复制叉，而复制叉的移动速度较原核生物慢，仅为原核生物的1/20，（约50nt/秒）。 三、DNA聚合酶 真核生物DNA聚合酶有： 1、 DNA聚合酶α，负责染色体DNA的复制。该酶大亚基负责聚合，小亚基负责引物的合成，由于缺乏3-5的外切活性， 可能参与滞后链RNA引物的合成。 2、 DNA聚合酶δ 负责DNA链的延伸，该酶需要增殖细胞核抗原（PCNA）来协助。其主要

功能类似于原核生物DNA聚合酶的β亚基，形成一个环行的钳子，增加DNA聚合酶δ复制的连续性。 RFA 是真核生物的DNA单链结合蛋白 RFC 促进复制复合物的组装。

四、也有冈崎片段 100-200个（核甘酸） 五、需要DNA连接酶 六、端粒的复制 线形DNA的末端为端粒，是在端粒酶的作用下完成的。端粒酶是一种RNA酶。

后随链中RNA引物的切除与gap产生及由端粒酶对DNA5’端的延长 染色体末端复制-端粒与端粒酶 后随链中RNA引物的切除与gap产生及由端粒酶对DNA5’端的延长

PCNA(proliferating cell nuclear antigen)同源三聚体结构、

真核DNA复制模型（示聚合酶开启与后随链岗崎片段过程）

七、DNA复制的忠实性 在大肠杆菌DNA的复制中，每聚合10的9次方到10的10次方个碱基的才出现一个错误。 1、碱基配对原则 2、引物RNA的作用 3、DNA聚合酶的校正阅读作用 返回

第五节 反转录（RNA指导的DNA聚合） 一、反转录（逆转录） 是以RNA为模板合成DNA的过程。 反转录酶的酶活性 2.RNase H活性 3.DNA指导的DNA聚合酶活性 4、需要引物

二、反转录酶及其作用过程

一、突变导致肿瘤发生 第六节 DNA的损伤和修复 1、突变 DNA核甘酸顺序的永久性改变 2、点突变 用一个碱基对替换另一个碱基对的突变。 2、点突变 用一个碱基对替换另一个碱基对的突变。 3、插入作用或缺失作用 增加或缺失一个碱基对或多个碱基对的突变。 4、沉默突变 突变影响非必需DNA或突变对一个基因功能的影响是可以忽略的。 5、回复突变 有些突变可以克服第一次突变造成的影响。

A、极少数菌出现在无组氨酸培养基上。 B、C、D、加入含有诱变剂的滤纸。 基于诱变作用的致癌物检测

二、DNA的损伤 一个哺乳动物基因组24小时内可以积累成千上万个DNA的损伤，但由于DNA修复的结果，一千个这种损伤只有一个没有被修复而成为突变。

三、DNA的修复 （一）、错配修复 错配修复依赖模板链提供的信息。 因此、生物体必须有一个区分模板链和新合成链的机制，细胞往往采用甲基化的方式来为模板链加上标签。甲基化位置在GATC序列的A上。

原核生物DNA的错配修复需要12种以上的蛋白质

（2）、甲基指导的DNA错配修复完成

（二）、碱基切割修复

（三）、核甘酸 切割修复

五、重组修复与差错修复

第七节、转录与“加工” 1958年Crick所提出的分子生物中心法则图解

模板链和非模板链 模板链、负链、无意义链 用作RNA合成模板的链 非模板链、正链、有意义链、编码链 互补于模板链的DNA链。

一、 原核生物转录过程 （一）、转录 以DNA为模板合成RNA的过程 1、原核生物的转录 1）、E、coli RNA 聚合酶结构与功能 由α2ββω由核心亚基和σ因子组成 （2）、 coli RNA 聚合酶负责所有RNA的合成

RNA 聚合酶结构与功能 a2bb’ s

2）、启动子 E.coli 起动子的代表性序列

3）、原核生物转录步骤 （1）、RNA聚合酶全酶结合于启动子部位 （2）、聚合作用的起始 （3）、链的延伸 （4）、链的终止

（1）、起始： 闭合启动子复合物的形成 开放启动子复合物的形成

（2）、原核生物转录中链延伸期过程

（3）、终止 依赖ρ因子的终止 不依赖ρ因子的终止

E.coli trp 操纵子终止位不依赖ρ因子的终止

2、转录终止的ρ因子作用机理

（2） 真核生物转录过程 1）、真核生物RNA聚合酶 （1）、 RNA聚合酶Ⅰ负责 rRNA(5.8S、18S、28S) 的转录 （2）、 RNA聚合酶Ⅱ负责mRNA的转录 （3）、 RNA聚合酶Ⅲ负责tRNA和5SRNA的转录

2）、真核启动子 部分的真核基因TATA盒

3、真核转录起始 人类细胞基本转录起始因子表

真核生物RNA聚合酶Ⅱ在启动子上的转录

3）转录的选择性抑制 （1）、放线菌素D 抑制原核和真核生物的转录 （2）、利福霉素 抑制原核生物的转录 （2）、利福霉素 抑制原核生物的转录 （3）、 α-鹅膏蕈碱 抑制真核生物的转录

二、加工 （一）、mRNA的加工 1、真核生物mRNA的加工 1）、添加帽子结构 2）、添加尾巴结构 3）、除去内含子

mRNA前体的后加工过程 真核mRNA的加帽与甲基化 前mRNA的加帽

真核mRNA 3’ 端多聚化 转录时3’端多聚腺苷酸的添加

真核前mRNA5‘端不同特定位点的甲基化

剪辑过程：套索结构形成 mRNA前体的剪辑过程

小核糖核蛋白体参加剪辑过程 哺乳类mRNA二级结构U1snRNA组成

剪辑需要大量反平行RNA碱基对的重新组织

小核糖核蛋白体形成剪接体 剪接体装配过程

（二）、rRNA的加工 1、原核生物rRNA的加工 2、真核生物rRNA的加工

（三）、tRNA的加工 1、除去先导序列和尾部序列 2、添加CCA结构 3、碱基修饰（甲基化、脱氨和还原等）

（四）、RNA的编辑 1、编辑 2、编辑体 3、编辑的机制 4、编辑的意义 返回