同济医院感染性疾病研究所 同济医院感染科 宁琴 教授 肝细胞死亡的基础与临床研究 同济医院感染性疾病研究所 同济医院感染科 宁琴 教授

内容 1 肝细胞死亡的模式 2 肝细胞死亡与肝脏疾病 3 肝细胞死亡的调控 4 结论

肝细胞死亡的模式 肝细胞死亡 坏死 凋亡 继发于 启动原因 重型病毒性肝炎 死亡受体/配体 缺血/再灌注损伤 DNA损伤 生长因子缺乏 急性药物性肝炎 被动过程 显著的炎症反应 凋亡 启动原因 死亡受体/配体 DNA损伤 生长因子缺乏 主动过程 程序性细胞死亡

细胞坏死与凋亡的形态区别

旧观点 新观点 凋亡与坏死被认为是两种截然不同的现象 凋亡与坏死是源于相同启动因素和信号转导途径的不同的细胞死亡方式，而线粒体功能损伤在这一过程中起到关键的连接作用。

线粒体是细胞生命活动的控制中心 细胞呼吸链中心 线粒体 细胞凋亡调控中心 氧化磷酸化中心

凋亡存在两条不同的信号传导途径 一类细胞中含有足够的Caspase8可被经典的死亡受体活化，直接激活效应Caspase；

线粒体在凋亡中的作用

坏死和凋亡是线粒体透化的不同结果 缺血再灌注，肝细胞毒素（N-乙酰苯醌亚胺 NAPQI ，胆酸，死亡受体活化等） 集中作用于线粒体，导致其膜透化。 Bcl2家族成员包括caspase 8 活化形成的tBid,导致外膜透化。其透化可能包括外膜通道的形成或是线粒体肿胀破裂后诱导MPT。 其他应激因素可直接导致MPT.膜透化后，细胞色素C释放相继激活caspase 9 和caspase 3，从而诱导细胞凋亡 。而由于线粒体功能的严重异常，ATP减少，caspase 活化被阻断则会发生坏死。

肝细胞死亡与肝脏疾病 1 死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤 2 穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤 3 缺血/缺氧诱导的肝细胞损伤 胆酸诱导的肝细胞损伤 4 药物诱导的肝细胞损伤 5

1.死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤 目前认为在肝脏中发挥重要作用的死亡受体主要包括 Fas、TNFR1及TRAIL-R1/R2，后者与它们相应的配体 FasL、TNFα和TRAIL结合后可诱导受体发生寡聚化并活 化其胞内的死亡结构域，与相应的连接蛋白相互作用进 而触发凋亡的级联反应。

1.死亡受体/配体诱导的肝细胞损伤 Fas/FasL诱导的肝细胞损伤 1. TRAILR/TRAIL诱导的肝细胞损伤 2. 3. TNFR1/TNFα诱导的肝细胞损伤

1）Fas/FasL诱导的肝细胞损伤 Fas在肝实质细胞、血窦内皮细胞、星状细胞及枯否氏细胞上具有广泛的表达。 自然杀伤细（NK）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）可通过分泌FasL启动凋亡程序来清除病毒感染 的肝细胞或肿瘤细胞。

NK细胞杀伤自身肝细胞的机制 Hepatology. 2004 J Exp Med. 2007 Hepatology. 2007

CTL细胞对肝细胞的杀伤作用

1）Fas/FasL诱导的肝细胞损伤 研究发现 当HCV特异性的FasL表达的CTL被动移植至稳定表达HCV结构蛋白的小鼠体内后，小鼠肝细胞出现损伤，血清谷丙转氨酶（ALT）水平升高。 在HBV转基因小鼠中，HBV特异性CTL也能导致急性肝损伤甚至肝衰竭 酒精性肝炎患者的血清中可以发现其可溶性Fas的表达也是上调的 酒精和HCV病毒可在Fas信号转导途径诱导的肝脏损伤中发挥协同作用 非酒精性脂肪肝患者中，其Fas的表达和肝细胞凋亡的发生也是增加的。 Fas诱导的凋亡在暴发性肝衰竭的发生发展中也占有一席之地

2）TRAILR/TRAIL诱导的肝细胞损伤 研究发现 病毒性肝炎患者中其血清TRAIL的表达水平显著增高； 小鼠肝细胞在病毒感染后也能诱导上调TRAIL的表达，通过TRAILR/TRAIL途径诱导感染肝细胞的凋亡。

Fas 和 TRAIL 受体信号 Fas 和TRAIL 的死亡诱导信号复合物 (DISC) 类似. TRAILR1/TRAIL-R2或Fas 与其配体 TRAIL或FasL结合后，通过与死亡结构域(DD)的同型反应招募调节蛋白FADD。 FADD 包含死亡效应结构域(DED)，可招募并分裂procaspase 8 和10, 使其活化。 Caspase 8 将Bid分裂为tBid，致使线粒体透化，功能失常和凋亡。

3）TNFR1/TNFα诱导的肝细胞损伤 正常肝细胞中TNFR1的表达水平很低，但各种急慢性肝脏疾病中，TNFR1会在肝实质细胞、血窦内皮细胞和炎性浸润细胞中大量表达。 除了诱导凋亡途径，TNFα还能通过NFκB依赖的基因表达途径促进肝细胞的增殖，在部分肝切除后肝细胞的再生中起重要作用。 TNFR表达过量时会导致肝细胞损伤加剧而肝脏再生失败。

3）TNFR1/TNFα诱导的肝细胞损伤 在肝脏移植中，供体与受体的TNFR1发挥相反的效应，表现为供体TNFR1的缺陷可加剧移植物的损伤，而受体TNFR1缺陷时肝损伤有所缓和且炎性细胞浸润减少。 在酒精性肝炎患者中，其血清TNFα和TNFR1的水平均上升并与死亡率相关。 病毒性肝炎患者中，其TNFα的水平与治疗应答反应呈负相关。

TNFa受体介导的信号 TNF与TNFR结合后，与TRADD, RIP, TRAF-2共同形成Complex I，激活 NFkB 和JNK. NFkB 激活某些survival gene(包括抗凋亡蛋白c-FLIP, IAPs, Bcl-XL和 A1)的转录。 Complex I 经过修饰和内化形成Complex II (DISC) ,后通过与DD的相互作用及激活procaspase 8来招募FADD（Fas相关死亡结构域）。活化的 caspase 8 将Bid （促凋亡蛋白）分裂为 tBid, 转移至线粒体后导致其透化，功能障碍及凋亡。

2.穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤 胞浆中,是CTL和NK细胞发挥细胞毒效应的另一重 要途径。 穿孔素(perforin)主要存在于CTL和NK细胞的 胞浆中,是CTL和NK细胞发挥细胞毒效应的另一重 要途径。

2.穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤 穿孔素可在靶细胞膜上形成跨膜孔道 1）引起细胞渗透性改 变、钙离子内流和能 量的耗竭，导致靶细 胞融解和细胞死亡。 2）穿孔素形成的跨膜通 道可以使颗粒酶 （granzyme）进入靶 细胞，颗粒酶进一步 通过蛋白水解激活 Caspase家族的某些 成员触发Caspase级 联反应，导致靶细胞 凋亡。

2.穿孔素/颗粒酶诱导的肝细胞损伤 研究发现，穿孔素在慢性乙肝肝细胞损伤中发 挥了重要的作用，也是慢性丙肝患者肝细胞损伤 的主要效应分子。

3.缺血/缺氧诱导的肝细胞损伤 1.缺血-再灌注损伤 2.免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死

1）缺血-再灌注损伤 发生于肝脏的缺血-再灌注损伤可分为两个阶段: 第一阶段 反映了直接的肝细胞损伤。 第一阶段 反映了直接的肝细胞损伤。 第二阶段 涉及到天然免疫系统的激活，特别是缺血后肝 脏枯否氏细胞的活化，以及中性粒细胞、淋巴 细胞的炎性浸润。

缺血-再灌注损伤 在肝细胞的体外热缺血-再灌注损伤模型中 ，肝细胞急剧肿胀坏死。 体内肝脏发生缺血-再灌注损伤后，其急性阶段也主要表现为肝细胞的坏死。

缺血-再灌注损伤 其他观点 缺血-再灌注损伤后，肝细胞的凋亡和坏死是并存的，损伤的强度和持续时间决定了细胞的死亡方式，即严重的损伤会导致早期发生的肝细胞坏死，而轻度的损伤则发生延迟的凋亡反应。

免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死 fgl2凝血酶原酶 Serine 89 fgl2凝血酶原酶 属于纤维蛋白原超家族，由活化巨噬细胞或内皮细胞产生，可直接催化凝血酶原转变为有活性的凝血酶，从而快速启动凝血过程，促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血栓形成。 Domain1 N-terminal Linear Procoagulant Domain 2 C-terminal Globular FRED Fibrinogen like protein 2 (FGL2), also known as fibroleukin, was first cloned by another group from cytotoxic T lymphocytes. The FGL2 sequence share significant homology (36%) to fibrinogen - and - chains .( page down) It was therefore classified as a fibrinogen-related superfamily member and named FGL2. However, by that time its function is still unknown. (Page up) The earlier work in our lab related with viral hepatitis revealed a procoagulant molecule expressed by murine monocyte, this molecule was functionally cloned by cDNA library screening using some neutralizing monoclonal antibody. The sequence showed that it is exactly the FGL2 and it function as a novel prothrombinase, which can directly activate prothrombin to thrombin in the absence of factor VII or factor X . (superlink to slide 4) Later, the human and pig fgl2 gene were also cloned and it is highly conserved between species. Studies demonstrated that the prothrombinase activity of FGL2 was involved in the pathogenesis of several diseases, including viral-induced fulminant hepatitis, fetal loss syndrome, and xenograft delayed rejection, several major directions of our lab now. We don’t have a crystal x-ray image but according to the fluorescence staining and software analysis it was showed as a type II membrane protein. The predicted 3 D structure consist mainly 2 domains, a linear N terminal region and a globular C terminal region. The procoagulant activity was believed to reside in domain1. So, what is the function of domain 2? Several evidences implicate it may have an immunomodulatory function. By the way, the coagulation system was also deemed as an essential part of innate immunity, by restricting the pathogen and attract the leukocytes. (superlink to slide 5) Levy GA. Et al. 2000. Molecular and functional analysis of the human prothrombinase gene (HFGL2) and its role in viral hepatitis. Am J Pathol. Apr;156(4):1217-25. Yuwaraj S. et al. 2001. Genomic characterization, localization, and functional expression of FGL2, the human gene encoding fibroleukin: a novel human procoagulant. Genomics. Feb 1;71(3):330-8.

免疫凝血途径诱导的肝细胞坏死 系列研究发现，活化巨噬细胞（内皮细胞）/fgl2凝血酶原酶介导的免疫凝血途径可通过促进肝脏纤维素沉积和微血栓形成引发肝脏的微循环障碍，最终肝细胞 缺血缺氧，ATP合成障碍而触发肝细胞坏死的发生。 J Virol, 1997, J Immunol 1998, J Clin Invest 2003, 中华医学杂志２００３ W J G 2006, Human Gene Therapy 2006，中化肝脏病杂志　２００４，２００７ J Biol Chem. 1999, and J Biol Chem 2003

肝内枯否氏细胞、内皮细胞fgl2高表达， 是暴发性肝炎肝细胞坏死的重要机制 necrosis Coagulatoin activation Kupffer Cells/ Macrophages Fulminant viral hepatitis apoptosis necrosis Coagulatoin activation Fgl2 prothrombinase IFN HC FasL Caspase cascade Inflammation cytokines Fas CTL Virus VAg TCR

胆酸诱导的肝细胞损伤 体外细胞培养体系中，毒性胆盐可以通过Fas或TRAIL依赖的途径引起肝细胞凋亡。 在急性胆汁淤积的发生中，Fas及其他信号途径也能导致严重的线粒体功能障碍及ATP的耗竭，促进细胞坏死的发生。

药物诱导的肝细胞损伤 在美国对乙酰氨基酚的过量使用是造成急性药物性肝损伤的主要原因 肝细胞凋亡与坏死共存于对乙酰氨基酚诱导的肝损伤： 1）当药物造成了ATP的完全耗竭，肝细胞坏死发生； 2）当D-果糖与甘氨酸的运用减缓了ATP的耗竭，则Caspase诱导的凋亡途径占优势。

肝细胞死亡的调控 1. 正常肝细胞死亡的干预 2. 异常肝细胞死亡的诱导

正常肝细胞死亡的干预 Caspase抑制剂 抗氧化剂 凋亡坏死关键基因的RNA干扰 细胞因子 中草药 血浆置换

异常肝细胞死亡的诱导 选择性的增加肿瘤细胞对于TRAIL介导的凋亡途径的敏感性，有助于清除肝脏肿瘤细胞，保护正常的肝细胞。 通过药物和基因干预手段靶向诱导某些非肝实质细胞（星状细胞）进行凋亡，可能会抑制或扭转肝纤维化的发生发展。

结论 肝脏疾病中的多种因素均能导致肝细胞通过凋亡或坏死 途径发生死亡。 肝细胞的凋亡与坏死并非完全独立的两条通路，而是代表了 细胞死亡同一胞内途径尤其是线粒体途径的两种不同结果。 关于肝细胞坏死与凋亡的基础和临床研究将加深我们对于 各种肝脏疾病发病机制的了解，对于肝脏疾病的预防和 治疗将起到重要作用。