植物茎顶端和叶的发育

第一节 侧生原基的定位和起始 茎顶端分生组织结构（Shoot Apical Meristem，SAM） : 表皮L1层、表皮下层细胞L2、中心区域（Central Zone，CZ）、周围区域（Peripheral Zone, PZ）、周围区域包围的中肋区（Rib Zone，RZ或Rib Meristem, RM）。

中心区域是干细胞（原分生细胞）区域，具有分裂活性但不如分生组织细胞分裂活性高，由这些细胞衍生形成周围区域和中肋区域。从周围区域特定区域细胞分裂形成侧生器官原基 。

一、茎顶端分生组织光诱导的基因表达与相关功能 激素的作用 黑暗中茎顶端分生组织的生长被抑制，光下迅速恢复生长。 光照的最初六小时，生长素、乙烯、脱落酸控制上调表达的基因被光照下调表达，反之，三种激素控制下调表达的基因被光照控制上调表达，生长素、乙烯与光的关联性比脱落酸强。 细胞分裂素调控的基因与光调控的基因表现一致，即光照上调细胞分裂素控制上调表达的基因，在光照六小时时达到最高峰 。 赤霉素水平在茎顶端被光动态调控。使赤霉素失活的GA2ox2在光照后1小时达到高峰，与光照早期赤霉素作用高峰后的迅速下降现象一致。此外两个赤霉素合成基因和一个失活基因在光照两小时达到高峰。

光照下调甾类激素下调表达的基因。 两个负调控甾醇类激素水平的基因phyB Activation-tagged Suppressor1、 Brassinosteroid - Insenstive2被光照下调表达，而介导甾醇信号传导的两个基因BRI1-EMS Suppressor1 和Brassinazole-Resistant1被光照在叶原基中上调表达。说明甾醇类激素在原基发育过程中起作用。

光照0-1小时，生长素、赤霉素活性急剧降低，光信号传导活性升高，到1小时时达到高峰，分生组织专一的KNAT1基因、细胞分裂素信号、核糖体、与细胞周期G2/M转变有关的蛋白cyclinB1；1、子叶类囊体蛋白在光照1小时都有一个小峰，与赤霉素抑制酶GA2ox2高峰一致。 光照两小时，光信号传导蛋白tranducin继续在峰值，查尔酮合酶表达达到高峰。 光照六小时，核糖体、细胞分裂相关的周期蛋白cyclinB和D、代表DNA合成的组蛋白H2A、类囊体蛋白基因表达达到高峰，这些基因同时在子叶中也达到高表达。这些数据显示细胞分裂在光照六小时后达到高峰。 细胞分裂高峰与生长素水平下降和细胞分裂素上升有关。

在茎顶端分生组织发育中，生长素、细胞分裂素在特定的时间和部位发挥作用，同时生长素和细胞分裂素之间有复杂的相互作用。 生长素在胚轴诱导内源细胞分裂素合成和细胞分裂素的信号传导，诱导除了ARR3以外其他ARR的表达 ，还诱导降解细胞分裂素的细胞分裂素氧化酶的表达，迅速降低细胞分裂素的水平 ，这两类相反的作用可能在特定的区域分别发生。 细胞分裂素通过影响生长素运出载体PIN的分布改变生长素反应的区域，细胞分裂素氧化酶2和3的过量表达下调PIN2、3、4、7的表达 ，说明细胞分裂素上调这些载体的表达。玉米中细胞分裂素A类反应因子ABPH1上调PIN1的表达，细胞分裂素负调控茎顶端分生组织大小，生长素则正调控PIN1的表达。

细胞分裂素在生长素诱导浓度低于临界浓度时单独作用不能诱导器官发生，说明生长素在器官发生中的主导作用。 但细胞分裂素在胚后茎顶端分生组织分生组织的发育是必不可少的，使细胞分裂素失活的35S::AtCKX1和35S::AtCKX3的过量表达引起叶蔟的延迟形成，35S::AtCKX2和35S::AtCKX4的过量表达则不影响 。

生长素和细胞分裂素在茎顶端分生组织的分布受到各种因素的精细调控，从而造成特定区域的细胞分裂和分化的精细调控。 生长素在分生组织中合成，上调PIN1的表达。茎顶端分生组织中生长素反应限制在L1层发生 。生长素由原基向周围区域输入 ，在生长素运出载体PIN和运入载体AUX1、LAX1、2、3的共同作用下，生长素反应集中在茎顶端分生组织周围区域侧生原基起始的部位，在其他部位也有相应分布 。 生长素运入载体的三突变改变生长素反应的分布，影响侧生原基的起始 。 生长素反应蛋白转录因子（ARF5） 、生长素运出载体突变体 形态异常。

生长素反应标记DRF5::GFP ；生长素运出载体PIN和运入载体AUX1、LAX1、2、3 ；

MONOPTEROS（MP）生长素反应蛋白转录因子（ARF5）;侧生组织标记基因ANT 、AS1。 NPA-生长素运输抑制剂。

KNOX基因 、WUSCHEL(WUS)基因及信号传导CLV类基因。 茎顶端分生组织分化的关键基因 促进细胞分裂繁殖的基因： KNOX基因 、WUSCHEL(WUS)基因及信号传导CLV类基因。 细胞分裂素通过WUS基因和CLV信号调控细胞分裂。

KNOX基因是一类同源盒基因，拟南芥KNAT1（又称BP, BREVIPEDICELLUS）、2、6、STM（Shoot meristemless）是KNOX类型I基因，在茎顶端分生组织表达。KNAT3、4、5、7是II类KNOX基因。拟南芥KNAT1、2在茎顶端分生组织普遍表达，生长素类对KNAT1在茎顶端分生组织的表达没有明显影响，细胞分裂素和光扩大KNAT1在茎顶端分生组织的表达范围 。STM和KNAT1的作用部分重叠 。 KNOX I类基因具有促进细胞分裂和延长的特性 。不同的KNOX基因在不同的部位与不同的因子相互作用，被限制在特定区域表达，促进相应部位的细胞分裂和器官发育。 玉米野生型KN1在茎的皮层表达运输到表皮，在SCR启动子控制下分布在L1、2、3层 。拟南芥KNAT1、2、STM蛋白也可以从茎顶端分生组织内部向L1进行单向细胞间移动 。KNOX同源盒区域的功能足以完成KNOX蛋白质和mRNA的细胞间移动功能 。

STM编码含有MEINOX三个氨基酸环的HD转录因子，其MEINOX区域与BLH (Bell-like homeodomain) 类型的转录因子中的BELL区域结合，形成异源聚合体，这种结合对于它们进入细胞核是必需的。 在茎顶端分生组织，两种BELL转录因子BLH3和9在SAM特定位点表达，与STM结合。因此STM在顶端分生组织中的功能可能因此也具有不同特性 。 STM在茎顶端分生组织中心区域和周围区域表达，不同部位表达量受到相应区域各种不同因子的控制。 STM诱导细胞分裂周期蛋白CYCB1;1的表达，CYCB1;1促进细胞由G2进入M期，从而促进细胞分裂。STM还诱导KNAT1和2的表达，抑制侧生器官发育促进因子AS1(ASYMMETRIC LEAVES1)的表达。 WUS诱导干细胞特性，但不诱导KNAT1、2的表达和细胞分裂。STM和WUS共同维持干细胞分生区的特性 。

KNAT6在茎顶端分生组织的周围区域表达 ，在胚发育中表达时期晚于STM，与STM作用重叠共同保持分生组织特性。KNAT2不具有这个作用 ，KNAT1和PNY(PENNYWISE, KNOX类基因RPL)在花序顶端分生组织限制KNAT6和2的表达，保证花序形态的正常 ，茎顶端分生组织中KNAT1可能具有相似的作用。

侧生器官分化的决定基因 近轴类基因：HD ZIPIII类编码的PHABULOSA (PHB)、 PHAVOLUTA（PHV）、REVOLUTA（REV） 、CORONA（CNA） 远轴类基因： 编码的YABBY类蛋白FILAMENTOUS FLOWER(FIL)和YAB3 及KANADI 、AS1 边缘类基因： CUP-SHAPED COTYLEDON(CUC)

HD ZIP III类基因PHB、PHV、REV、CORONA（CNA）在发育的胚中通过影响PIN1的分布，影响生长素反应。 近轴类基因 HD ZIP III类基因PHB、PHV、REV、CORONA（CNA）在发育的胚中通过影响PIN1的分布，影响生长素反应。 一类小ZIP蛋白ZPR3\ZPR4与PHB等HD ZIP III类蛋白在ZIP区域结合，形成异源聚合体，负调控HD ZIP III类的活性，zpr3-2 zpr4-2双突变体分生组织活性改变，干细胞保持异常。PHB正调控ZPR3的表达 。

ANT(AINTEGUMENTA)与FIL和YAB3启动子结合， 促进它们的表达。 远轴类基因： YABBY类蛋白FILAMENTOUS FLOWER(FIL)和YAB3在茎顶端分生组织的周围区决定侧生器官远轴特性 。它们抑制KNOX类基因STM、KNAT1、KNAT2 的表达。 ANT(AINTEGUMENTA)与FIL和YAB3启动子结合， 促进它们的表达。 FIL和YAB3与LEU(LEUNIG)、LUH(LEUNIG-HOMOLOG)、SEUSS和SEUSS相关蛋白形成复合体，对胚性茎顶端分生组织的起始、胚后茎顶端分生组织的保持、叶子的近轴和远轴特性都起着重要作用 。 KANADI和YABBY共同控制叶片远轴特性。KANADI类的KAN1、2、3在器官发生中具有重叠作用，共同决定远轴特性，抑制HD ZIPIII类的PHABULOSA (PHB)、 PHAVOLUTA（PHV）、REVOLUTA（REV）的近轴功能 。

在茎顶端分生组织与子叶和侧生原基的边界分离中，共同保持分生组织的结构和子叶的分离 。 边缘类基因 在茎顶端分生组织与子叶和侧生原基的边界分离中，共同保持分生组织的结构和子叶的分离 。 cuc1和2的双突变子叶完全融合，呈杯状。 PIN1和MP表达影响CUC1和2的表达分布，pin1mp双突变体CUC1表达范围扩大，CUC2表达范围缩小，表明PIN1和MP在外侧抑制CUC1的表达，在内侧促进CUC2的表达。 CUC1和2的表达对STM的表达是必需的，双突变体胚中STM不表达。STM表达后抑制CUC2的表达。当活性的STM发挥功能时，CUC2在STM活跃区域下调表达，只剩在STM不表达的周围区域表达，这时进入鱼雷期，子叶分开，与顶端分生组织形成边界，CUC在此区域表达 。

CUC与STM 的相互作用

二、侧生原基的定位起始 最初侧生原基起始细胞的发生和分布在L1层和L2层， 是单独的 。

拟南芥茎顶端分生组织侧生原基的形成速度大约每24小时形成一到两个侧生原基 。 侧生原基的形成和增大 :从分生组织聚集新的细胞和侧生原基中已有细胞的有丝分裂两个阶段组成周期性的循环进行，每个周期小于24小时 。 ANT:GFP 新的侧生原基细胞的聚集表现在ANT在新的细胞的表达 E、F

各侧生原基平均分裂指数相当。但原基从P2-P3的转变期细胞指数急剧上升，24小时可达193%。L1、L2和中间区域的变化相似。 细胞分裂频率在茎顶端分生组织中心区域(CZ)远低于周围区域(PZ)，每个区域内单个细胞之间分裂频率也不同 。 要进行分裂的细胞是单独调控的，细胞分裂的方向也是根据生长环境单独调控的。

中心区、周围分生组织区及原基的发生过程中细胞分裂的频率与光照后72小时的基因表达趋势中，与细胞分裂有关的周期蛋白cyclin B1;1和cyclin D3;3在1小时和六小时的表达量是一致的。六小时处的峰值是72小时中表达量的高峰，1小时处cyclinB1;1有一个小峰，可能与CZ中原基的起始分裂有关 。 细胞分裂的停止不影响细胞分化，没有细胞分裂的早期仍有CZ区衍生的细胞表达ANT，转变进入侧生原基 。

茎顶端细胞分裂的方向是与原基形成的突起方向一致，分裂轴向与近-远轴向垂直的较多，初次分裂多是这个方向

侧生原基的突起是由于结构内细胞的不等分裂和细胞定位和定向扩张引起的三维结构的构成。 1。细胞分裂产物大小不等，2，细胞分裂定位进行。3，细胞分裂频率不同，4，细胞分裂周期不同 在原基内、原基边缘和原基之间细胞分裂的频率和周期长度不同，边缘细胞周期长度最短 。

表9.1 茎顶端分生组织各侧生原基转化过程中细胞分裂情况 原基区间 P-1-P0 P-2-P1 P1-P2 P0-P1 P2-P3 分裂细胞数 20 21 19 26 29 细胞总数 30 28 38 15 细胞分裂率% 67 72 68 193

A-L中绿色是生长素运出载体PIN1标记。 A\B红色标记是CUC，C中兰色标记是WUS，D-F红色标记是REV，兰色是叶绿素； G-I红色是FIL； J-L兰色是STM，红色是WUS; M-O CLV3标记绿色，PIN1标记白色，WUS标记红色 。

第二节 叶发育和叶型建成 叶的形态建成包括叶脉网络的形成、极性确定、组织分化、器官生长和扩张。在这个过程中，在特定的时间、空间、特定的基因表达调控下进行有序的细胞分裂和分化活动。极性的确定包括近轴-远轴、顶端-基部、中心-边缘。叶组织由表皮、叶肉细胞（海绵组织-远轴、珊栏组织-近轴）、维管束组成。

一、叶脉网络的定位和形成 叶脉是叶片中支持叶结构、提供营养物质的维管束网络，是植物叶结构的基本骨架，决定了叶片的形状。叶脉网络结构的发育和建成从叶原基开始，始终伴随着叶的发育和形态建成，是叶片发育和形态建成的关键组成。 生长素是维管束形成的关键因素。从叶原基开始生长素决定维管束形成是通过叶原基表皮和幼叶边缘表皮中生长素会聚点及已存在的维管束相对位置决定的。生长素的分布通过生长素运出载体和运入载体及生长素合成、分解和转化的酶共同调控。在几种生长素运出载体中，只有PIN1的表达分布与维管束定位、分布和形成的完全一致，时间上早于维管束前原形成层标记基因ATHB8(KNOX类基因)和原形成层标记基因ET1335的表达 。生长素反应因子在叶中原分生组织中表达，叶维管束形成过程中在前原形成层和原形成层中表达，决定叶中维管束网络的形成和类型 。

DR5:GUS作为维管束形成的指示基因

叶原基中主脉的形成 原基中生长素分布在L1层，由叶原基表皮中生长素会聚点决定生长素运输方向朝向亚表皮和原基内部中心，及生长素外运载体PIN1在会聚点下原基内基本组织细胞中向基分布，确定未来维管束形成部位 。

次级叶脉的形成 在存在维管束的情况下，PIN1表达分布列在表皮的会聚点和主脉维管束之间1/2距离处形成，这种分布决定了初级叶脉区的形成部位，这种初级叶脉区首先在叶基部形成，随后在上端同样聚叶边缘（表皮会聚点）和主脉维管束或已经形成维管束的下部初级维管束之间进一步形成次一级的维管束，这种过程完全通过PIN1的表达分布表现出来 。 更高一级的叶脉也是在叶边缘表皮生长素会聚点和已存在叶脉之间确定新的PIN1表达目标，并延伸形成连续的生长素运输通道和维管束预定位（Scarpella et al., 2006）。无论是次级叶脉还是更高级的叶脉预定位过程中，PIN1最初都在较大范围分布，一定时间后才缩小范围，聚集到未来维管束分布的区域，表现出未来维管束的轮廓 。

二、叶片生长、极性的确定和组织分化 叶的生长分化是建立在细胞分裂和分化的基础之上。生长素在器官发生中起主要作用，细胞分裂素在生长素诱导的器官发生中起修饰作用。生长素通过抑制细胞分裂素合成迅速抑制细胞分裂素的水平，相反，细胞分裂素对生长素的水平调控很缓慢。细胞分裂素在茎端可以大量合成 。 生长素诱导细胞分裂素反应基因除ARR3以外的其他A类ARR表达，细胞分裂素受体AHK4、3、2在这个过程中起依次重要的介导作用。器官发生中细胞分裂素通过影响生长素运出载体的分布改变生长素的分布，从而改变生长素反应的区域。细胞分裂素氧化酶2和3的过量表达下调PIN2、3、4、7的表达 。

生长素受体除了TIR1外还有ABP1，在胚后茎顶端分生组织发育过程中，对细胞分裂频率、细胞板的形成、细胞形状、细胞内分裂类型、细胞扩张都有影响。生长素运入载体AUX1和其相似的LAX1、LAX2、LAX3在气生器官的分布和生长素的渗透补充PIN1介导的极性机制，以适应环境和发育需要。 AUX1：：GUS在幼叶边缘、SAM两侧、新生侧生原基表达。LAX1：：GUS在幼叶顶端表面、SAM周围区域新生原基突起处表达。LAX2::GUS在幼叶叶肉、SAM周围区域内部特定区域表达。 生长素提高几种KNOX I类基因的表达。KNOX I类基因具有促进细胞分裂和延长的特性。在叶中不同部位，不同的因子与KNOX I类基因相互作用，抑制和调节细胞分裂和分化活动。

叶原基起始时期，决定侧生原基特性的ASYMMETRIC LEAVES1在叶原基中表达上调，同时 KNAT1基因表达下调，玉米ROUGH SHEATH2（RS2）、金鱼草的PHANTASTICA （PHAN）与拟南芥的AS1类似，属于MYB类转录因子，与DNA结合蛋白(具亮氨酸拉链和半胱氨酸重复序列)AS2、RNA结合蛋白（RIK）、染色质修饰蛋白HIRA形成复合体，抑制KNOXI类基因的表达，其表达分布与KNOX互补。 KNOX的下调表达引起AS1的起始表达，标志叶分生组织与茎顶端分生组织与叶原基的分离。AS1AS2复合体在叶片发育过程中与其他不同类型的基因产物在不同的部位抑制KNOXI类基因的表达，as1和as2基因的突变导致叶发育过程中细胞分裂周期分布的改变，as2突变体变化更为显著。这种变化可以通过决定细胞分裂的周期蛋白CYCB1；1：：GUS的分布表现出来。as1和2突变体中生长素反应部位也发生显著变化。

AS1和AS2对叶片中细胞分裂部位分布的影响

Development of primordia of eighth foliage leaves (Leaf 8primordia) stipules (S) margin of leaf primordia. enlarged cells at margin (F) Section taken 25% above leaf base. (G) Section taken 50% above leaf base. monitored with cyclin1At::GUS reporter gene that acts as a specific marker of the G2/M phase of the cell cycle. gl1 leaves

AS1和AS2对叶片中生长素反应（DR5::GUS）分布的影响

近轴远轴极性的决定 生长素分布将维管束原形成层预先定位，但由原形成层分化形成各种专一类型的细胞还需要多种其他因子的共同作用。叶片近远轴建立，表现在维管束木质部分布在近轴端，而韧皮部分布在远轴端。此外，叶近轴远轴极性由近轴-远轴叶表皮细胞的形态、叶肉细胞中海绵组织、珊栏组织分布和结构、维管束木质部和韧皮部背脊的分化表现出来。

决定叶原基和叶片中近轴-远轴极性的因子有远轴特性KANADI（KAN1、2、3）和YABBY、近轴特性HD ZIPIII类的PHABULOSA (PHB)、PHAVOLUTA（PHV）、REVOLUTA（REV）和AS1 。 近轴-远轴极性因子相互抑制，与其他调控因子如LEU、LUH、SEU和SLK等一起，调控促进细胞分裂延长的KNOX等类型的基因在特定的时间和部位表达，使叶子表现出近轴远轴的极性。

远轴决定的YAB类蛋白与LEU、LUH、SEU和SLK蛋白按一定组合形成复合体。 SEU编码metazoan Lim结合的转录因子，与LEUNIG转录共调节基因结合。拟南芥有三个SEUSS-LIKE (SLK)基因，是转录因子适配子，具有重叠作用。SLK2 和SEU对生长素信号传导、STM和PHB的表达都具有促进作用 。 yabfil双突变体叶没有远轴端特性。偶尔在远轴中肋形成茎分生组织。它们的作用重叠，单突变表型变异不明显，使叶中KNOX类基因（STM、KNAT1、KNAT2）去抑制，并使 stm表型部分恢复。双突变在子叶和叶片的近轴表面形成异常分生组织，因此YAB类基因将KNOX的表达限制在茎顶端和叶片的特定区域，同时保证远轴叶面特性的形成 。

KANADI (KAN)也控制叶原基的远轴端特性。它编码的蛋白含有一个保守的 GARP区域，与DNA特定序列结合。在叶和花原基的远轴端表达，KAN：：GUS在洋葱表皮细胞核中分布。35S控制的KAN的恒定表达胚轴缺乏SAM和维管组织。kan突变体的片层生长依赖YABBY的功能，KAN1、2、3在器官发生中具有重叠作用，共同决定远轴特性，抑制HD ZIPIII类PHB、PHV、REV的近轴功能。 KAN与生长素反应有关，KAN1、2、3突变体PIN1分布在侧向有额外分布，导致侧生原基形成，植株形态异常（Izhaki and Bowman, 2007）。 生长素反应因子ARF3(ETT)也影响KAN的活性，ett突变体KAN活性受到抑制，arf3 arf4的双突变导致所有气生组织远轴组织转变成近轴组织，与kan突变体相似。YAB、KAN共同调控远轴细胞分化。

REV基因编码一个同源盒亮氨酸拉链(HD-ZIP)转录因子，含有START 甾醇脂类结合区（Sterol-Lipid Binding Domain）。REV在侧生茎端分生组织和花分生组织最早时期表达，该基因决定侧生分生组织和叶原基分生组织活性以及维管组织类型。 与REV相似的HD ZIP III类基因还有PHB、PHV、CNA(ATHB15)、ATHB8, 它们在拟南芥发育过程中的作用具有重叠、佶抗、独特的作用特点。 PHB、PHV、REV重叠的作用与PHB、PHV、CNA重叠的作用不同。

CNA、ATHB8的作用在某些组织与REV作用佶抗，在另一些组织与REV作用重叠。 PHB在叶原基早期整体表达，后期在近轴端表达并增强。PHB控制SAM与叶原基相邻区域和叶原基近轴端的基因表达。 ATHB-8、-9、-14、-15、REV都在维管束中表达，ATHB15(CNA)是早期维管束发育中专一决定维管束前形成层细胞特性的关键转录因子，athb15突变体木质部在韧皮部外侧。 生长素正调控ATHB-8的表达，ATHB-8也在拟南芥发育中限制在前维管束细胞中表达，但ATHB-8的增强表达促进木质部的发育。

HD ZIP III类蛋白除了受相似小分子ZIP蛋白反馈调控外，还受小分子RNA的调控。 MiRNA165和MiRNA166与HD ZIP III中START区域互补，MiRNA165调控PHB、PHV、REV、ATHB8的蛋白水平，MiRNA166调控CNA（ATHB15）的水平。 RNA依赖的RNA聚合酶 (RdRP)催化双链RNA的合成，RDR6基因增强AS2的功能，rdr6as2双突变体中MiRNA165和166水平提高，而PHB、REV、ATHB8、ATHB15水平下降，但ATHB15下降不显著，BP表达异常。说明RDR6AS2通过miRNA调控HD ZIP III的蛋白水平。

顶端-基部极性的决定 KNATM是一类只含有Myeloid ecotropic viral integration site (MEIS)-KNOX（MEINOX）区域，不含同源（homeodomain）序列的转录因子，与BELL TALE通过MEINOX区域结合，与KNOX蛋白通过酸性线圈区域、不依赖同源区域结合。KNATM在器官原基基部侧面和成熟器官边缘表达，具有决定叶基部-顶部极性的功能。 顶端边缘皆是生长停止区域，knatm缺乏同源序列，可能丧失促进细胞分裂活性，因此在边缘顶端终止叶子的细胞分裂繁殖活动。

近轴-远轴特性基因本身影响叶片中近轴和远轴方向细胞的分化，如近轴表皮和远轴表皮结构、近轴珊栏组织、远轴海绵组织的分化。 组织分化 近轴-远轴特性基因本身影响叶片中近轴和远轴方向细胞的分化，如近轴表皮和远轴表皮结构、近轴珊栏组织、远轴海绵组织的分化。