Chapter Eleven Spectrophotometry Spectrophotometry, is one of the most widely used methods of analysis. It is used to measure the absorption capabilities of certain compounds with reference to wavelengths of light on the ultraviolet and visible light ranges.

Spectrophotometry High sensitive, can used microanalysis 1-10μg/L ( 10-6 g/L ) e.g. There is 10-8g Fe in 10ml solution, if titrate it using KMnO4 standard solution (c=2.0×10-4 mol/L), only consumed 0.02ml KMnO4 standard solution The instrumentation is readily available and generally fairly easy to operate. It is very widely used in clinical chemistry, hygiene analysis, medicine analysis

11-3 The Spectrophotometer 11-4 Typical Analysis Procedures 11-1 Properties of Light 11-2 Absorption of Light 11-3 The Spectrophotometer 11-4 Typical Analysis Procedures 11.5 分光光度分析法的误差和测量条件的选择

In spectrometric methods, the sample solution absorbs electromagnetic radiation from an appropriate source, and the amount absorbed is related to the concentration and path length(cm) of the analyte in the solution.

11-2 Absorption of Light Beer's law The amount of monochromatic radiation(单色光) absorbed by a sample is described by the Beer – Lambert law, commonly called Beer's law. Beer in 1729 and Lambert in 1760 recognized that when electromagnetic energy is absorbed, the power of the transmitted energy decreases geometrically (exponentially指数).

P ：power of transmitted Transmittance透光度 P0 ： power of incident radiation P ：power of transmitted radiation, T ：Transmittance C： concentration(g/L) b ：path length(cm). b Pr P0 P c c %T = 100 T

more useful quantity is the absorbance A : 当P0一定时，吸光度（A）与液层厚度（b）和 溶液浓度C有关： ① Po、c一定： A∝b ② Po、b一定： A∝c ∴ A = abc a is absorptivity (L/g.cm ) 吸光物质的性质、 入射光波长 及温度等因素有关。

Beer's law A: the absorbance is a dimensionless（无量纲） ratio. c: the concentration of the sample is usually given in units of mole/L . b: the pathlength is commonly expressed in centimeters. ε:is the molar absorptivity, the unit that tells how much light is absorbed for a given wavelength  has units of( L•mol-1•cm-1)

透光率和吸光度 If A = 0, then no photons are absorbed. If A = 1.00, then 90% of the photons are absorbed; only 10% reach the detector . If A = 2.00, then 99% of the photons are absorbed; only 1% reach the detector

光吸收曲线 最大吸收波长λmax选择 用不同波长的单色光照射某一吸光物质测定其吸光度，以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制曲线。描述物质对不同波长光的吸收能力。 例如：邻二氮菲合铁(II)配离子的反应：

图：不同浓度 邻二氮菲合铁(II)配离子的吸收光谱 λmax=510nm 吸收曲线 图：不同浓度 邻二氮菲合铁(II)配离子的吸收光谱 λmax=510nm

吸收曲线

吸收曲线的讨论： （1）同一物质对不同波长的光吸收程度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax 。 吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。 （2）同种物质浓度不同，其吸收曲线形状相似λmax不变。 在λmax处， A最大,并与浓度c 呈正比关系 ,测定最灵敏---- 定量分析依据。 （3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。

（4）从吸收曲线形状可以解释物质的颜色。物质的颜色与吸收光颜色互为补色。 光的互补：蓝 黄 注意：物质对光的吸收越多，呈颜色越深， 溶液浓度越浓。

11-3 The Spectrophotometer Major Components Wavelength Selector monochromator Sample cell Light source cuvette tungsten lamp a grating Light detector indicator scale phototube

1 光源 在紫外可见分光光度计中，常用的光源有两类：热辐射光源和气体放电光源 热辐射光源 用于可见光区，如钨灯 和卤钨灯； 气体放电光源用于紫外光区，如氢灯 和氘灯。

2 单色器 单色器的主要组成：入射狭缝、出射狭缝、色散元件和准直镜等部分。 单色器质量的优劣，主要决定于色散元件的质量。色散元件常用棱镜和光栅。

3 吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯，按材料可分为玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外区。 吸收池的种类很多，其光径可在0.1~10cm之间，其中以1cm光径吸收池最为常用。

4 检测器 检测器的作用是检测光信号，并将光信号转变为电信号。现今使用的分光光度计大多采用光电管或光电倍增管作为检测器。 5 信号显示系统 常用的信号显示装置有直读检流计，电位调节指零装置，以及自动记录和数字显示装置等。

11-4 Typical Analytical Procedures First, measure the baseline using a blank sample. reagent blank containing all reagents, but with analyte replaced by distilled water. Second, measure the zero by inserting the beam block. This corrects the instrument for the detector background.

Determination process of sample: 1. Choice maximum absorbed wavelengh 2. Determination of sample: 1）Calibration curve method 2）Direct compare method

Serum Iron Determination

1) Calibration curve method prepare a series of standards solution to establish a calibration curve the unknowns be prepared using the same procedure as for standards solution

(ferrozine)3Fe(Ⅱ) complex . Figure 11- 5: Calibration curve showing for the (ferrozine)3Fe(Ⅱ) complex .

2) Direct compare method

（二）紫外吸收性质 aa的一个重要光学性质是对光有吸收作用: 可见光区域均无光吸收 在远紫外区（‹220nm）均有光吸收 在紫外区（近紫外区）（220nm—300nm） 只有苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸三种AA有 光吸收能力，(因为它们的R基含有苯环共 轭双键)。 苯丙AA最大光吸收在259nm、 酪AA在278nm 色AA在279nm

257=2.0x102 苯丙AA最大光吸收在259nm 酪AA在278nm 275=1.4x103 色AA在280nm 因此, 利用分光光度法依据是朗伯—比尔定律 测定蛋 白质的含量。

核酸的紫外吸收 核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质，在260nm处核酸紫外吸收最强。 220 240 260 280 0.1 0.2 0.3 0.4 波长（nm） 光吸收 1 2 3 核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱，因而具有紫外吸收的的性质，在260nm处核酸紫外吸收最强。 核酸的紫外吸收是核酸定量测定的基础。 纯DNA OD260/OD280=1.8 纯RNA OD260/OD280=2.0 1 2 3 天然DNA 变性DNA 核苷酸总吸收值

Example 1 A sample in a 1.0 cm cell is determined with a spectrometer to transmit 80% light at a certain wavelength. If the absorptivity of this substance at this wavelength is 2.0, what is the concentration of the substance(g/L).

solution1 The percent transmittance is 80%, and so T=0.80, a =2.0,b=1.0

Example 2 A solution containing 1.00mg iron (as the thiocyanate [硫氰酸盐] complex) in 100mL was observed to transmit 70.0% of the incident light compared to an appropriate blank. (a) What is the absorbance of the solution at this wavelength? (b) What fraction of light would be transmitted by a solution of iron four times as concentrated?

Solution 2 (a): T=0.700 (b): c=0.01g/L A=a b c 0.155=a b (0.0100g/L) a b=15.5L/g Therefore

The absorbance of the new solution could have been calculated more directly:

显色反应（color reaction） 显色反应：待测物质是无色或很浅的颜色，需要 选适当的试剂与被测离子反应生成有色化合物再 进行测定，此反应称为显色反应，所用的试剂称 为显色剂（color reagent）。 按显色反应的类型来分类，主要有氧化还原反应 和络合反应两大类，而络合反应是最主要的。

显色反应的选择 A 选择性好，干扰少，或干扰容易消除;灵敏度高， 有色物质的ε应大于104。 B 有色化合物的组成恒定，符合一定的化学式。 C 有色化合物的化学性质稳定，至少保证在测量过 程中溶液的吸光度基本恒定，不容易受外界环境 条件的影响。 D 有色化合物与显色剂之间的颜色差别要大，即显 色剂对光的吸收与络合物的吸收有明显区别，要 求两者的吸收峰波长之差Δλ(称为对比度)大于60 nm。

11.5 分光光度分析法的误差和测量条件的选择 1 对朗伯-比尔定律的偏离 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线 11.5 分光光度分析法的误差和测量条件的选择 1 对朗伯-比尔定律的偏离 在吸光光度分析中，经常出现标准曲线不呈直线 的情况，特别是当吸光物质浓度较高时，明显地看到 通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种 情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行 定量，将会引起较大的误差。

（1）溶液浓度引起的偏离 ◎ 测定时应选择适当的浓度范围，控制 A = 0.2 ~ 0.7 范围因为透射比很小或很大时，浓度测量误差都较大。

（2）非单色光引起的偏离 * 朗伯-比尔定律只适用于单色光。 若入射光是某一波段的复合光，由于物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯－比尔定律的偏离。 ◎ 使用比较好的单色器，从而获得纯度较高的 “单色光”，使标准曲线有较宽的线性范围。 ◎入射光波长选择在被测物质的最大吸收处，保证测定有较高的灵敏度，

（3）介质不均匀引起的偏离 （4）由于溶液本身的化学反应引起的偏离 如果被测溶液不均匀，是胶体溶液、乳浊液或悬浮液时，入射光通过溶液会有一部分被试液吸收，另一部分因散射现象而损失，使透射比减少，导致实测吸光度增加，使标准曲线偏离直线而弯曲。 （4）由于溶液本身的化学反应引起的偏离 溶液中的吸光物质常因解离、缔合、形成新化合物或互变异构等化学变化而改变其浓度，因而导致偏离朗伯—比尔定律。

表11-2 参比溶液的选择与配制方法 参比溶液 配制方法 使用情况 溶剂空白 试剂空白 试样空白 褪色空白 表11-2 参比溶液的选择与配制方法 参比溶液 配制方法 使用情况 溶剂空白 试剂空白 试样空白 褪色空白 直接用溶解试样的溶剂（如水、乙醇）等作空白 在溶剂中加相应的显色剂，不加试样溶液 直接以试样溶液作空白，不加显色剂 在试样溶液中，加入适量掩蔽剂，将被测组分掩蔽，使之不与显色剂作用，然后，再加入显 色剂作空白 在试样溶液和显色剂均无色时 显色剂有色，而试样溶液无色或吸收很小的情况时 当试样溶液本身有颜色，而显色剂无色 试剂和显色剂均有颜色时

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