核酸实验研究技术进展－2 增强或抑制生物系统中目标基因表达

核酸实验研究技术进展－2 增强生物系统中目标基因表达

增强生物系统中目标基因表达实验技术路线 确定目的基因 1. 化学合成法 2. RT－PCR法 获得目的基因cDNA 3. cDNA文库克隆 核酸实验研究技术进展－2 增强生物系统中目标基因表达实验技术路线 确定目的基因 1. 化学合成法 2. RT－PCR法 获得目的基因cDNA 3. cDNA文库克隆 关键环节一：合理 构建表达载体 关键环节二：筛选 细胞转染 表达效果检测

来源于PCR产物、cDNA克隆、限制性酶切片段的目的基因可以与供体载体通过BP反应形成入门克隆（entry clone）。 核酸实验研究技术进展－2 来源于PCR产物、cDNA克隆、限制性酶切片段的目的基因可以与供体载体通过BP反应形成入门克隆（entry clone）。 目的基因可以在入门克隆与多种载体间通过LR反应进行转换，形成表达克隆。

核酸实验研究技术进展－2 抑制生物系统中目标基因表达

反义封闭目标基因表达技术 反义封闭目标基因表达的两个关键环节： 目标基因转录后剪接加工环节 目标基因mRNA翻译起始环节 核酸实验研究技术进展－2 反义封闭目标基因表达技术 反义封闭目标基因表达的两个关键环节： 目标基因转录后剪接加工环节 目标基因mRNA翻译起始环节

NGAL基因转录RT-PCR的检测结果 核酸实验研究技术进展－2 NGAL GAPDH M 1 2 3 4 1 2 3 4 M  200 bp 600 bp  113.7 100. 0 ﹣ 80.0 ﹣ 60.0 ﹣ 40.0 ﹣ 20.0 ﹣ 100.0 99.7 102.9 100. 0 ﹣ 80.0 ﹣ 60.0 ﹣ 40.0 ﹣ 20.0 ﹣ 106.5 108.6 100.0 相对光密度 相对光密度 38.2 1 2 3 4 1 2 3 4 NGAL基因转录RT-PCR的检测结果 M, DNA marker, 100bp ladder; 1, SHEEC without plasmid; 2, pcDNA3; 3, pcDNA-NGAL(+); 4, pcDNA-NGAL(-).

细胞培养上清液中MMP-9和MMP-2的活性 核酸实验研究技术进展－2 细胞培养上清液中MMP-9和MMP-2的活性 kD 212 170 116 76 53 M 1 2 3 4 MMP-9 MMP-2 300 ﹣ 250 ﹣ 200 ﹣ 150 ﹣ 100 ﹣ 50 ﹣ 600 ﹣ 500 ﹣ 400 ﹣ 300 ﹣ 200 ﹣ 100 ﹣ 251.4 542.6 相 对 密 度 单 位 相 对 密 度 单 位 MMP-9 MMP-2 100.0 100.0 3.8 25.0 0.0 0.0 1 2 3 4 1 2 3 4 M. 蛋白marker，1. 培养液空白对照，2. 食管癌细胞对照 3. 有义促进NGAL基因表达的食管癌细，4. 反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞 结果表明通过有义、反义技术使NGAL基因表达发生改变可以对食管癌细胞分泌的MMP-9和MMP-2的活性产生明显影响。

(B) 实验组1：有义促进NGAL基因表达的食管癌细胞SHEEC (C) 实验组2：反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞SHEEC 核酸实验研究技术进展－2 食管癌细胞裸鼠移殖瘤HE染色（400） (A) 对照组：食管癌细胞SHEEC (B) 实验组1：有义促进NGAL基因表达的食管癌细胞SHEEC (C) 实验组2：反义封闭NGAL基因表达的食管癌细胞SHEEC 结果表明，反义封闭NGAL基因表达会明显抑制食管癌裸鼠成瘤细胞的浸润行为。 （A） （B） （C）

激光共聚焦检测NGAL基因表达反义封闭后食管癌细胞的形态 核酸实验研究技术进展－2 由永生化食管上皮细胞恶变的食管癌细胞 永生化食管上皮细胞 反义封闭NGAL基 因表达的食管癌细胞 激光共聚焦检测NGAL基因表达反义封闭后食管癌细胞的形态 结果表明，反义封闭 NGAL基因表达后，食管癌细胞 F-actin的分布变得均匀，F-actin小体减少，细胞间连接重新建立，结构较紧密，细胞的整体形态与永生化食管上皮细胞相近。

RNA干扰（ RNA interference，RNAi） 核酸实验研究技术进展－2 RNA干扰（ RNA interference，RNAi） RNAi的定义 发现RNAi现象的科学意义 RNAi研究发展简史 RNAi 技术路线的选择 RNAi技术应用举例

核酸实验研究技术进展－2 RNA干扰的定义 某些短片段双链RNA能够以序列互补基因mRNA为靶标，促使其降解，高效特异地阻断基因表达，诱使细胞表现相应基因缺失表型。这种现象叫做RNA干扰（ RNA interference）。

为后基因组时代研究基因的功能提供了有力工具。 核酸实验研究技术进展－2 发现RNAi现象的科学意义 深刻揭示了细胞内基因沉默的机制。 为后基因组时代研究基因的功能提供了有力工具。

98 Fire and Mello, Nature: RNAi 95, Guo and Kemphues, Cell: sense and antisense has the same effects in C. elegans 98 Fire and Mello, Nature: RNAi 98, Kennerdell and Carthew, Cell: inject dsRNA into fly embryo to induce RNAi 99, Tuschl Sharp, G&D: dsRNA induces RNAi in cell extracts 99, Hamilton Baulcombe, Science: small RNA as guide in plant 00, Hammond Hannon, Nature: isolate RISC 00, Zamore Bartel, Cell: 21-23 bp intermediate 01, Elbashir Tuschle, Nature: siRNA 04,Yukihide Tomari, Science: siRNA asymmetry incorporate into RISC 05, …… 06, ………… 核酸实验研究技术进展－2

核酸实验研究技术进展－2 First found in C.elegans: dsRNA represses gene expression much more effectively than antisense Mex-3 RNAi by in situ hybridization in embryos No Staining Antisense RNA dsRNA Andrew Fire et. al. Nature 1998, Carnegie Institution of Washington

RNAi实验技术路线 1. 化学合成siRNA 确定目的基因 2. 体外转录siRNA 关键环节一：合理 3. siRNA表达载体 核酸实验研究技术进展－2 RNAi实验技术路线 1. 化学合成siRNA 确定目的基因 2. 体外转录siRNA 关键环节一：合理 3. siRNA表达载体 设计siRNA序列 4. siRNA表达框架 关键环节二：纯度 获得siRNA产物 关键环节三：效率 siRNA转染 RNAi效果检测

核酸实验研究技术进展－2 RNAi应用举例 通过RNAi干扰fascin基因表达

核酸实验研究技术进展－2 Passage 7 Passage 8 Passage 9 PSC NT ←Fascin ←β-actin PSF1 PSF2 0.96 0.08 0.55 1.00 ←Fascin/β-actin ratio

核酸实验研究技术进展－2 NT PSF

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