丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路 梅柱中 病理生理学教研室

MAPK是细胞信号转导研究领域的热点 MAPK 24802 3070 ERK 22751 2930 JNK 13413 1626 p38 20468 2462

本章主要内容： MAPK信号通路的成员 MAPK通路的组织模式 MAPK的功能及其调控机制 MAPK信号转导通路间的关系

丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) Ser/Thr蛋白激酶 受细胞外刺激而激活 通路组成 — 三级激酶模式 在所有真核细胞中高度保守 调节多种重要的细胞生理/病理过程

一、MAPK 信号通路的成员 哺乳动物细胞中: MAPK是信号从细胞表面→核内的重要传递者。 MAPK激酶激酶 (MKKK, MAP3K) 20 种 MAPK激酶 (MKK, MAP2K) 7 种 MAPK 12 种

哺乳动物MAPK MAPK 其他名称 ERK1 p44 MAPK 88 ERK2 p42 MAPK 100 ERK3α 同一亚族成员序列相似性% ERK1 p44 MAPK 88 ERK2 p42 MAPK 100 ERK3α p62 rat ERK3 43 ERK3β human ERK3 42 74 JNK1 SAPKγ 40 87 JNK2 SAPK α 41 JNK3 SAPK β

哺乳动物MAPK MAPK 其他名称 p38 α p38 CSBP 50 100 p38 β p38 -2 47 75 p38 γ 与ERK2的同源性% 同一亚族成员序列相似性% p38 α p38 CSBP 50 100 p38 β p38 -2 47 75 p38 γ ERK6 SAPK3 44 62 p38 δ SAPK4 42 64 ERK5 BMK1 51 ERK7 41

MKK(MAP2K)： MEK (MAPK/ERK kinase) MKK MEK4 MEK6 MEK3 MEK7 MEK5 MEK2

MKKK（MAP3K): Raf亚家族: A-Raf, B-Raf, Raf1 MEKK亚家族：MEKK1-4 ASK1, Tpl2亚家族 MST， SPRK， MUK， TAK1，MOS等

二、MAPK的蛋白结构 （一）MAPK的一级结构 苏氨酸磷酸化位点与其他蛋白激酶同源，酪氨酸磷酸化位点是MAPK独特的。 磷酸化位点的三肽模体 — TXY ERK和ERK5 — TEY p38 — TGY JNK — TPY MAPK是通过Thr和Tyr的双位点同时磷酸化而被激活。

家族成员之间具有较高的同源性 各亚族都具有12个保守亚区 — 真核细胞蛋白激酶超家族区分标志之一 三肽模体位于L12 各亚族L12长度不同 活化唇 (activation lip)

（二）MAPK的二级结构和超二级结构 以ERK2为例 N端域 — 主要由β折叠和2个α螺旋组成 （1~109和320~358位氨基酸残基） C端域 — α螺旋，含磷酸化唇和MAPK插 入，催化环（Arg-147~152) （110~319位氨基酸残基） 交界处的裂隙 — ATP结合位点

(b) Structural representation of ERK (b) Structural representation of ERK. Sequences not recovered from peptide digests are colored gray. (c) Structural representation of ppERK as in b, rotated slightly clockwise (as viewed down the vertical axis) to more clearly show the major differences with the inactive form, the reorganization of the activation lip (yellow arrow) and the formation of a 3/10-helix near the C terminus (green arrow).

Superposition of ERK2 (green and gold) and ERK2-P2 (blue and red) using corresponding Ca atoms within the C-terminal domain (residues 109–171, 205–245, 272–310). The molecules have been rotated by about 908 about the vertical axis relative (A) and (B) to show domain rotation and closure. Refolded segments are highlighted in red and gold, respectively.

（三）MAPK的空间结构特征 大体结构：非常相似 底物结合口袋的结构特征：无活性时被阻断，有活性时暴露出。 ATP结合位点的结构特征：大小、形状、疏水性和电荷等不同 磷酸基团结合位点： 4个保守位点 ERK2：Arg-146, Arg-170, Arg-65, Arg-68

Electron Density for pThr and pTyr Electron density map, in the vicinity of the phosphorylation lip and the P+1 specificity pocket of ERK2-P2, 4个保守的磷酸化结合位点：Arg-146, Arg-170, Arg-65, Arg-68

三、MAPK通路模式 生长因子、细胞因子、射线、渗透压 MAP3K、MEKK MAP2K, MEK ERK, JNK/SAPK, p38, ERK5/BMK 转录因子、蛋白激酶、细胞骨架蛋白等

四、MAPK的激活机制 是通过Thr和Tyr的双位点同时磷酸化而被激活 例：ERK2 — Thr-183, Tyr-185 pY185 — 解除L12对底物结合的阻断 MAPK是Pro指导的蛋白激酶 如ERK2底物的一般保守性序列为 Pro-X-Ser/Thr-Pro • MAPK的活性受活化环的氨基酸序列中的双磷酸化所控制 其活性增加达1000倍以上。

活化环中Tyr-185 和Thr-183的磷酸化，引起该环重新折叠，与Arg结合位点相互作用 酸性氨基酸替代，不导致组成性活化

五、酵母MAPK通路 酿酒酵母 — 已鉴定出5条 单倍体的交配途径 浸润性生长通路 细胞壁重构通路 双组分渗透压感受器通路 Sho1渗透压感受器通路

（一）酵母菌中MAPK模式的组成和作用 酿酒酵母： 4种 MKKK 4种 MKK 6种 MAPK: 其中4种参与已明确的5种MAPK通路, 另外2种 (SMK1, YKL161C)参与未知的MAPK通路 3个成员通过与支架蛋白结合而联在一起

（二）单倍体酵母与交配有关的通路 酿酒酵母的2种交配型(单倍体)： a细胞型和 α细胞型 2种信息素(pheromone)： 7次跨膜受体：Ste3和 Ste2 异三聚体G蛋白： Gpa1 — α亚基 Ste4 — β亚基 Ste18 — γ亚基

upon stimulation by mating pheromone, Gbg is released from heterotrimeric G protein and recruits scaffold signaling complex to membrane Ste20  Ste11  Ste7  Fus3 activation of genes for cell cycle arrest & cell fusion Ste5 is essential for signaling

支架蛋白 ( Scaffold proteins) 主要功能是将其他蛋白质结合在一起，促进它们之间的相互作用。 含有许多蛋白结合域 将细胞信号通路中的各种信号分子结合在一起，形成复合物 起生理性隔室化的效应,从而防止该通路与其他通路发生交联

（三）浸润通路 缺乏氮源 — 形态改变 假菌丝：缺乏氮源时，椭圆型的双倍酵母进行不对称的细胞分裂以产生一个细而长的子细胞，后者又不断产生长的子细胞。由于母细胞与子细胞仍然相连，因此这种单级分裂方式的不断重复将产生由延长的细胞组成的丝状物。

KSS1： 丝状生长所需要 (单倍体，双倍体) 注： 未被Ste7激活时，是浸润生长的抑制物，被Ste7激活时，刺激浸润生长。

FUS3和KSS1的鉴别： 刺激激活的条件不同 FUS3 — 信息素 KSS1 — 缺乏氮源 表达不同 FUS3 — 单倍体细胞中 KSS1 — 单倍体细胞和双倍体细胞中 对浸润生长的调节作用 FUS3 — 抑制 KSS1 — 刺激

（四）细胞壁重构通路 • 酵母的生长依赖于有效的细胞壁重构 • PKC1：MKKKK • MKK1和MKK2的重叠作用意义不清

（五）渗透压感受器和应激通路 酿酒酵母的2种渗透压感受器： “双组分”渗透压感受器 低渗透压条件下激活 膜渗透压感受器 高渗透压条件下激活 2种渗透压感受器对MAPK通路的调节 作用不同

“双组分”渗透压感受器 “双组分”转导系统通常见于原核细胞 “双组分”转导体系的组成 感受器分子 — 胞外区 + 胞质His激酶域 + 反应-调节分子 — 接受域 + DNA结合域 是一种His-Asp磷酸化体系 “双组分”转导体系在哺乳动物细胞中尚未鉴定出

“双组分”转导过程 感受器蛋白活化 ↓ 胞质激酶域的His磷酸化 反应-调节分子接受域 的Asp磷酸化 启动输出功能，即转录激活作用

酵母 “双组分”渗透压感受器： 由3种蛋白组成 Sln1 + Ypd1 +Ssk1 两个相连的“双组分”体系 第一个 — Sln1 (His激酶域和接受域) 第二个 — Ypd1 (His激酶域) + Ssk1 (接受域)

在低渗透压条件下 Sln1 是有活性的 Ssk1是无活性的 HOG1也无活性 在高渗透压条件下 Sln1 是无活性的 Ssk1是有活性的 HOG1也有活性

2、Sho1依赖的渗透压感受器 Sho1：跨膜蛋白渗透压感受器 结构 ：4个跨膜区 + C-末端胞质区 ( 含SH3域)

在高渗透压条件下 Sho1 感受高渗透 Sho1激活Ste11 Pbs2发挥支架蛋白的作用 Pbs2含有多聚脯氨酸富集区

3、裂殖酵母菌中的渗透压感受通路 和应激通路 环境应激时激活2个相关的MAPK通路 WIK1/WIS1/SPC1通路 WIN1/WIS1/SPC1通路 (在渗透压应激时起主要作用) 上游调节因子Mcs4是Ssk1蛋白的同源物

SPC1只有经磷酸化后才能入核, ATF1是SPC1的主要核内底物 热休克和氧应激时SPC1磷酸化激活，但不需要WIS1的作用。

从以上酵母MAPK通路的研究中看到: MAPK通路是一个连续的蛋白激酶激活的途径； MAPK的主要底物为转录因子； MAPK通路受不同的上游因子调节； 信号转导是高度特异的； 某一种蛋白成员存在于数种通路时,支架蛋白起着隔室化的作用。

Signaling is highly specific, i. e Signaling is highly specific, i.e. given input always generates specific output even though pathway members are shared --How? Scaffolds function as a specificity factor by physically shielding pathway components and preventing them from participating in other pathways

Mechanism of Scaffold Functions • Ste5 and Pbs2 scaffold proteins are essential in each cascade • Scaffolds tether three kinases and inputs • Share MAPKKK Ste11 • No crosstalk under normal condition • How scaffold work? • Two models of scaffold function;

六、哺乳动物MAPK通路 哺乳动物MAPK通路不同于酵母: MAPK有多种亚族和多种不同的剪接体； 已鉴定出4条MAPK通路； 参与了对细胞增殖、分化、适应环境应激以及凋亡等的调控。 例如: 肥大细胞的IgE的高亲和力FcεR1可激活ERK 、 JNK和p38通路

（一）ERK通路 ERK：Extracellular signal regulated protein kinase ERK的MAPK有5种 (1~5)，它们分属于不同的亚族； ERK1和ERK2(ERK1/2)研究得最为透彻，为细胞内主要的MAPK； ERK3存在于细胞核； ERK4通过Ras依赖性通路而被激活。

1、ERK1/2通路中MKKK 许多受体通过活化Ras激活ERK1/2通路 Raf: 是该通路中的重要的MKKK 亚型: 有3种 — A-Raf、B-Raf、Raf1 组成: C-末端的激酶域 富含Cys的调节域 含Ras结合位点的调节域

表达: Raf1在体内广泛表达 而A-Raf 和B-Raf表达方式严格 如B-Raf 主要在神经组织中表达 激活: 酶水平的调节较复杂 主要包括2个过程: 一是结合于GTP- Ras 二是 磷酸化 (Ser338, Ser339, Tyr340, Tyr341)

Raf1对于H-、K-和N- Ras显示应答 B-Raf 可被Rap1a活化 TC21能够与Raf1和B-Raf相互作用，激活它们。 上游激酶的调节: 已知磷酸化Raf1的激酶有Src 、PAK、PKC及其他蛋白激酶

其他的磷酸化位点 Ser259和Ser621调节Raf1与14-3-3蛋白结合，稳定其活性。不过，14-3-3蛋白也可能抑制Raf活性。抑制性的磷酸化位点是由Akt (Ser259)和PKA催化的。 抑制：RKIP (raf kinase inhibitor protein ) 可干扰Raf-MEK的结合，抑制后者磷酸化和活化。

ERK1/ERK2通路的上游的MKKK还包括Mos、Tpl2、MEKK1、MEKK2和MEKK3

2、ERK1/2通路中MKK (MEK) MEK1和MEK2是该通路主要的MKK 为双特异性蛋白激酶； 通过两个残基的磷酸化而被激活( Ser或Thr)； 突变可引起其活性增加 (不同于MAPK)； 特异性较高，仅磷酸化少数底物。

MEK1和MEK2含3个非酶活性结构域 — ERK1/2结合位点 ( D域 ) 富含Pro结构域 核输出序列 ( NES ) MEK1 激酶域

MEK1和MEK2的上游调节因子 — Raf、RTK、非RTK、GPCR 在具有致瘤性的Ras转化细胞： Ras → Raf1 → MEK1 → ERK1/2 在心肌细胞： A-Raf → MEK1 → ERK1/2 在PC12细胞： B-Raf → MEK1 → ERK1/2

Signaling From Active Ras to MAPK

3、ERK1/2蛋白激酶的作用底物 底物的保守性磷酸化位点模体为 Pro-Leu-Ser/Thr-Pro 底物蛋白 — 超过150种 转录因子: Elk-1, Ets-1, Sap1a, c-Myc等 胞质蛋白: p90S6K 、cPLA2 、EGF 受体 细胞骨架: MAP1、2 、4 、Tau

4、ERK1/2通路的生物学功能 刺激细胞增殖 抑制细胞生长、分化 细胞周期调控 调控微管组织中心（MTOC） 纺锤体的组装 促进细胞存活

（二）JNK信号转导通路 1991年鉴定出的新的MAPK JNK: c-Jun N-terminal kinase 鼠的同源物则被命名为Stress activated protein kinase (SAPK)。 多种应激刺激，包括: 细胞因子与生长因子撤离、干扰DNA和蛋白合成的试剂、UV辐射、热休克、反应活性氧 (ROS)、高渗透压等都可以促进其活性增加。

（二）JNK信号转导通路 是已知的应答最多样刺激的细胞信号转导途径之一 JNK通过Thr-Pro-Tyr模体的磷酸化被激活

JNK: c-Jun N-terminal kinase 人的JNK由3个基因 ( jnk1, jnk 2和 jnk3)编码； JNK1和JNK2广泛地在多种组织表达，而JNK3 主要在脑、心脏与睾丸组织中表达 JNK家族成员间的同源性超过80%； 3个基因转录产物的选择性剪接产生10个JNK亚型 (46kDa, 55kDa)； 同一基因编码的46kDa和55kDa亚型无明显的功能差异 。

JNK信号通路MKK和MKKK MKK (MAP2Ks) MKK4 ( SEK1/MEK4/JNKK1/SKK1 ) 主要激活JNK，但对p38也有活化作用 可能是个抑癌基因 胚胎发育所必需 使细胞免于凋亡 MKK4的特异性比MKK1/2差。具有其他的底物

MKK7 (MEK7/JNKK2/SKK4 ) 主要激活JNK，但对p38也有活化作用 与MKK4相关，属于哺乳动物细胞MAPKK超家族 不同亚型应答不同的细胞外刺激和上游激酶

MKK4与MKK7在人和鼠组织中广泛表达，但在不同的组织中表达的丰度不同 MKK4与MKK7介导来自同一细胞外刺激的信号转导，但它们被不同MAP3Ks所激活。 与MEK1/2相似，采用酸性氨基酸置换磷酸化位点的氨基酸，可增加其激酶活性。

MEKK (MAP3Ks) 包括： MEKK1~4、 ASK1/MAPKKK5 MAPKKK6、TAK1 Tpl-2 、MLK2/MSK MLK3/SPRK/PTK1 MUK/DLK/ZPK LZK

MEKKs (MAPK/ERK kinase kinases) 因与酵母的STE11同源而被克隆 目前已克隆的4种称为MEKK1~4 首先鉴定出的激活JNK的MAP3K是MEKK1 在蛋白C-末端具有同源的激酶域，而它们的N-末端几乎无同源性

MEKK1和4与G蛋白Cdc42和Rac相互作用 MEKK1还可结合Ras MEKKs 也调节其他细胞信号转导途径 MEKK1~3激活ERK通路 MEKK3~4激活p38通路

ASK1/MAPKKK5 ASK2/MAPKKK6 ( Apoptosis signal-regulating kinase1) 应用PCR技术而被鉴定出 激酶域位于蛋白分子的中间 ASK1→ MKK4 → JNK ASK1→ MKK3 → p38 被TGF- α、FasL激活 诱导凋亡

JNK底物包括： 转录因子 c-Jun, Jun-D, ATF-2, ATFα, Elk-1 Sap-1a, GABPα, GABPβ 线粒体蛋白: Bcl-2, Bcl-xl, Bad, Bim, Bax 细胞骨架蛋白: Tau, Paxillin, MAP-2, -1B 促进蛋白质的降解:c-Jun, JunB, cFLIPL

JNK生理功能 参与细胞凋亡的调控 细胞存活 肿瘤的形成 机体的发育与分化

（三）p38信号转导通路 p38最初作为LPS刺激产生的酪氨酸磷酸蛋白而被鉴定出 p38与酵母HOG1具有明显的同源性 双磷酸化三肽模体 — Thr-Gly-Tyr 不同亚型的表达、激活和特异性不同 亚型之间有重叠的、不同的生理作用

p38的表达： p38α：白细胞、肝、脾、骨髓中等高表达 p38β：脑和心脏中高表达 p38γ：主要在骨骼肌中表达

p38的结构： N-末端、C-末端延伸短，与已知其他激酶无同源性 (p38家族成员和JNK亚型除外) 结构类似于ERK2，但活化环构象差异明显 ATP结合位点相对开放 磷酸化唇序列比ERK2短6个氨基酸残基

p38 信号转导通路的MKK和MKKK MEKs: MEK3和MEK6是细胞中p38激活的主要激酶。 不同的MEK选择性地激活不同的亚型

MEKKs: MEKK1~3参与p38激活 MEKK1→MEK4 → p38 (3T3细胞) MEKK3→MEK3 → p38 (转化细胞) MLK家族的4个成员参与p38激活 其他激酶：Tp12、ASK 、TAK (apoptosis signal-regulating kinase) (Tat-associated kinase)

上游调节因子 Rac、Cdc42、Rho家族的小分子GTPase是p38途径的较强的调节因子。 Rac/Cdc42 → PAK → p38

来自细胞表面的活化 异三聚体G蛋白可激活p38途径，但激活机制因细胞不同而异。 M1-乙酰胆碱受体-Gq/11 M2-乙酰胆碱受体-Gi β-肾上腺素受体-Gs (HEK293细胞) α1A-肾上腺素受体-Gs (PC12细胞) β-肾上腺素受体-Gi (ARVM细胞)

激活p38途径的物理、化学应激： 氧化应激 (巨噬细胞 ) 低渗压 (HEK293细胞 ) 紫外线辐射 (PC12细胞 ) 低氧 (牛肺动脉成纤维细胞 ) 循环扩张 (肾小球膜细胞 )

亚细胞定位： 细胞核、胞质 (免疫荧光显微镜) 应激反应，如心肌缺血、低氧时， 胞质 → 核 p38的抑制剂： 吡啶咪唑 — 结合于ATP结合位点延伸袋 p38 α, β — 敏感 p38 γ, δ — 不敏感

2、p38蛋白激酶的作用底物 作用底物: 细胞骨架 细胞应激 — 微管相关蛋白(tau) stathmin ( 癌蛋白18） 细胞质蛋白 刺激血小板 — cPLA2 血管紧张素Ⅱ — Na+/H+交换体 p38 δ — stathmin p38 α — cPLA2

ATF1/2 (activation transcription factor 1/2) 转录因子 ATF1/2 (activation transcription factor 1/2) CHOP10 (C/EBP-homologus protein 10 ) MEF2C (myocyte enhancer factor 2C) Max (myc associated factor X ) 下游的蛋白激酶 (MAPKAPK) MAPKAPK 2/3 MNK1/2 (MAPK-interacting kinase 1/2 ) PRAK (p38-regulated/activated kinase)

3、p38 信号转导通路的功能 主要参与应激反应 血细胞细胞因子的生成 (单核细胞：IL-1，TNF-α) 细胞凋亡 免疫反应调控

（四）MKK5/ERK5通路 ERK5 (BMK, big mitogen-activated kinase)： • MAPK家族中分子量最大的成员 故有BMK之称 • 与ERK2有52%的同源性 • 双磷酸化三肽模体为TEY MEK： MEK5 (α, β 两种亚型) 为其上游调节激酶

活化和上游调节因子 生长因子 应激 (如氧化应激、高渗透压 ) 血清 Src和Ras是ERK5信号转导途径的调节因子 GPCR (Gq和G12/13)也调节ERK5活性 MKKK— MEKK3、Tpl-2

ERK5的作用底物： MEF2家族 (A, C, D) Ets样转录因子Sap1a ( serum response factor acessory protein 1a)

（五）孤儿MAPK 1、ERK3亚型 研究最少 分为 ERK3α 和 ERK3β (74%同源性) 单一磷酸化位点 (Ser) 组成性定位于核

2、ERK7亚型 催化区与ERK2有40%的同源性 双磷酸化三肽模体 — Thr-Glu-Tyr 具有自我调节功能 氯通道相关蛋白可与非催化区结合 ( chloride intracellular channel protein 3)

支架蛋白（Scaffold proteins)

支架蛋白（Scaffold proteins) JNK通路与p38通路的支架蛋白： JIP1 (JNK interacting protein), JIP2, JSAP1/JIP3, JLP, POSH ERK通路的支架蛋白： KSR (kinase suppressor of Ras), β-arrestin, MP1 (MEK partner 1), MORG1 (MAPK organizer1), MEKK1

JNK通路与p38通路的支架蛋白

ERK5通路的支架蛋白

MAPK激酶的灭活 Ser/Thr磷酸酶: PP2A, PP2C Tyr磷酸酶: PTP-SL 双特异性的磷酸酶DUSP(dual spefificity phosphatase)或称为MKP(MAPK phosphatase) ERK1/2特异性的磷酸酶: DUSP6/ MKP3, DUSP7/MKP-X, DUSP9/MKP4 JNK的磷酸酶: MKP1, MKP5 p38α与p38β: MKP1, MKP4, MKP5 p38γ与p38δ: 抵抗所有的MKP磷酸酶

MAPK信号通路特异性的影响因素 刺激信号的强度与持续时间； 与不同的支架蛋白的相互作用； 细胞内的亚细胞定位； 多种选择性拼接体的存在； MAPK信号通路之间以及与其他信号通路的交互作用（cross-talk）； 其他蛋白质翻译后修饰的影响。

MAPK通路的功能 ERK1-/-小鼠无明显表型，发育正常，个别表现为运动活力增强、脂肪细胞分化受损； JNK1-/-小鼠大多表型正常，但个别Th2细胞因子表达增加、急性压力超负荷时心脏功能改善 JNK2-/-小鼠与JNK1-/-小鼠表型相似，还易肥胖

MAPK通路的功能 JNK1-/- JNK2-/-小鼠胚胎死亡，表现为严重的脑内凋亡调节障碍；

MAPK信号转导通路与疾病 1、与肿瘤的关系 ERK通路： K-Ras突变: 50%的大肠癌 B-Raf突变: 65%恶性黑色素瘤

MAPK信号转导通路与疾病 2、与神经退行性病变的关系 JNK通路与p38通路 3、Crohn’s病(一种胃肠道的慢性非特异性炎症性疾病 )

MAPK信号级联反应 Stimulus MAPKKK MAPKK MAPK Biological responses Stress, GPCR, Inflammatory cytokines, Growth factors Stress, Growth factors, Mitogen, GPCR Growth factors, Mitogen, GPCR Stimulus Raf, Mos, Tpl2 MEKK1, 4, MLK3, ASK1 MEKK2, 3, Tpl2 MAPKKK MLK3, TAK, DLK MAPKK MEK1/2 MKK3/6 MKK4/7 MEK5 MAPK ERK1/2 p38 MAPK JNK1,2,3 ERK5/BMK1 Growth, Differentiation, Development Inflammation, Apoptosis, Growth, Differentiation Growth, Differentiation, Development Biological responses 99