实验专题模块四 DNA的提取及特定DNA片段的鉴定 质粒的酶切鉴定 质粒的PCR鉴定

在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物 大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘与疾病研究的 中心课题 生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分 子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备 工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是 分子生物学研究的主要对象 DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本 的操作，往往是分子生物学实验的第一步。它是基因克隆、 分子标记、杂交检测等多种实验的基础。DNA质量的好坏， 甚至直接关系到后续实验的成败。

分离纯化DNA的一般原则： ①应保证DNA一级结构的完整性，完整的一级结构是保证核酸结 构与功能研究的最基本要求； ②排除蛋白质、脂类、糖类等其它分子的污染，纯化的DNA样品 不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子， 蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度； ③无RNA的污染。 因此，DNA提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与DNA 结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除RNA，沉淀核 酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的DNA。

注意与要求： ①减少化学因素对DNA的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷 酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行； ②减少物理因素对DNA的降解：强烈振荡、搅拌，细胞突置于 低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力以及高 温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分 子量小的环状质粒DNA分子，威胁相对小一些； ③防止DNA的生物降解：细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二 酯键，直接破坏核酸的一级结构；DNA酶需Mg2+、Ca2+等二价 金属离子的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合 剂EDTA，柠檬酸盐等，可基本抑制DNA酶的活性。进行 DNA分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上 进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。

实验一 质粒以及质粒DNA的提取 一、实验目的 1. 掌握质粒的基本知识及其在生命科学研究中的 应用。 2. 掌握碱裂解法提取质粒的原理与操作。

二、背景与原理 （一）质粒与质粒载体 质粒为染色体外的遗传单位，大小在1kb~200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。 质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。 质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在含抗菌素环境中生存，或宿主细胞在缺乏某种营养组分时候还能生存。 质粒含有启动子序列，能够自我复制。不过质粒的复制和转录都依赖于宿主编码的蛋白和酶，或能在胞质中进行自我复制，或整合到细胞染色体中作为细胞遗传物质的一部分随染色体一起复制。 质粒的特点使其成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。

在生命科学研究中，把目的DNA片段通过重组DNA技术， 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 （Vector）。 按组成元件的来源不同分为质粒载体、噬菌体载体、病 毒载体等。 质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含 有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所 以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及所 携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中 都是极为有用的。

载体按其行使的功能，分为克隆载体和表达载体。 克隆载体主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简单的载体。 如pUC18和pUC19，载体，其结构组成紧凑，几乎不含多 余的DNA片段。这些质粒缺乏控制拷贝数的基因，因此其拷 贝数达500-700。pUC系列载体含有一段lacZ蛋白氨基末端的部 分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。因此 在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成 的蓝白斑筛选重组质粒（图2-2）。

图2-2 pUC18 和pUC19质粒载体图谱

表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件 （如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的 载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的 大肠杆菌表达载体（图2-3）。其基本骨架为来自pBR322 和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元 件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游 有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5- 13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

图2-3 pKK223-3表达载体图谱

质粒由几个基本元件组成，如启动子区，多克隆位点（MCS）和抗性基因等。 以毕赤酵母表达系统中使用的表达载体为例，主要结构有5'AOX1 启动子片段、α-因子信号肽序列、多克隆位点、转录终止和polyA 形成基因序列（transcription termination，TT）、筛选标记（组氨酸脱氢酶基因，HIS4）、抗Amp（氨苄青霉素）基因和含复制位点的pBR322。如图2-4所示。 图2-4 质粒载体pPIC9谱图

5'AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可 启动外源蛋白的表达； α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外 源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化。 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点。 TT序列提供有效的转录终止和PolyA修饰信号。 HIS4为营养缺陷型筛选标志。 3'AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组。 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在 E.coli中筛选和复制。

（二） 质粒的提取 从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技 术中最基础的实验技能。分离质粒DNA一般有 三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解 细菌，分离和纯化质粒DNA。

质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法等。 以上方法总体而言，主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂 或碱进行处理及加热处理。 碱裂解法以产量高，费用较经济，而成为最常用的一种方法。 将菌体均匀悬浮； 在强碱和去垢剂的作用下将细菌壁裂解，菌体内的染色体DNA、 质粒DNA和大量的RNA在强碱环境下因双键之间氢键的解离而变性， 质粒DNA因超螺旋闭合而两条链不会完全分离； 随后用酸性高盐溶液将裂解液恢复至中性，大量的染色体DNA和 RNA部分复性，交织成网状不溶物； 再用1:1的饱和酚与氯仿混合物将残留蛋白质抽提掉； 无水乙醇沉淀质粒DNA; 70％的乙醇除去残留的盐份， 用含有RNA酶的溶液溶解质粒；

四、 实验操作 1. 取1.5ml菌液于1.5 ml离心管中，室温下8,000 rpm离心1min （收集菌体）。 2. 弃上清，加入100 µl 4℃预冷的溶液Ⅰ，充分漩涡混匀（溶 液Ⅰ中的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速地沉到管子 底部；Tris-HCl可以维持整个反应的pH值；EDTA则可以螯合 体系中的二价金属离子，抑制DNA酶的活性）。 3. 加入新鲜配置的溶液Ⅱ200 µl，温和颠倒4～6次至半透明状； 此步骤不宜时间过长，避免细菌基因组DNA甚至质粒在碱存在 下断裂（NaOH使得细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的转变，进而使细胞壁破裂；SDS会与蛋 白质结合且可以增强NaOH的碱裂解作用）。

4. 加入150 µl 4℃预冷的溶液Ⅲ，上下剧烈振荡混匀至出现 白色絮状后于冰上放置3min后，室温下12,000rpm离心5 min。 5. 转移上清至另一新离心管中，加入等体积（约400µl）酚： 氯仿溶液，混匀，12,000rpm室温离心2 min。 6. 取上清至另一新离心管，加入800 µl无水乙醇，上下振荡 混匀，室温放置2 min，12,000rpm室温离心5 min。 7. 弃上清，加入1 ml 70％乙醇，12,000rpm室温离心2 min。 8. 弃上清，室温下空气中干燥约10 min，加入50 µl TE（pH 8.0）缓冲液溶解质粒DNA。室温下放置30 min，使RNase 消化未降解的RNA。 9. 紫外分光光度法测量所提质粒的浓度与纯度，并登记在实 验记录本上。

实验二 质粒的酶切鉴定 一、实验目的 1. 掌握限制性内切酶切割DNA的原理与应用。 2. 掌握琼脂糖电泳的原理与操作，以及水平电泳 仪的使用方法。

质粒中含有两个Bgl Ⅱ的 酶切位点 （CAGATCTG），分别 位于原始质粒的第2bp和 第5622bp处。BglⅡ酶能 将pPIC9-NGAL质粒切成 两个大小不同的片段（约 6.2kb与2.4kb）。

三、实验操作 1.酶切体系的配置（10ul）： BglⅡ酶0.5µl 10×BufferH 1 µl 质粒DNA0.5 µg

2. 配制1%琼脂糖凝胶： 1) 天平上称取琼脂糖1g，至于烧瓶中。 2) 加入100 ml的1×TAE 电泳缓冲液，混匀后放于 微波炉或电热炉上加热至沸腾融解（注意防止沸腾 的凝胶溢出）。 3) 待冷却到50～60℃，按5 µl/ 100 ml凝胶的比例 加入EB（具有潜在的致癌作用，进行相关操作时 请戴手套），倒入电泳槽模具中，插入梳子。 4) 20-30min后，待凝固完全，轻轻拔掉梳子，置 于电泳槽中，加入电泳缓冲液备用。

3. 从37℃水浴中取出酶切产物，掌式离心机上 离心20s，加入2 µl DNA上样缓冲液，轻轻混匀。 4. 将混合物加在琼脂糖凝胶梳孔中，并加2µl的 未酶切质粒和1Kb plus DNA Marker作为对照， 电压80V电泳约30-40min。 5. 将凝胶置于紫外灯下观察，并拍照，鉴定酶 切效果，是否有预期大小的DNA片段。

四、预期结果 图2-8质粒酶切后电泳图

实验三 质粒的PCR鉴定 一、实验目的 1. 了解并掌握PCR基因扩增的基本原理。 2. 熟悉PCR基因扩增技术的具体操作过程。

二、背景与原理 PCR即聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）， 是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物 为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母 链模板DNA互补的子链DNA的过程。 图2-9PCR的原理与过程

PCR基本步骤 一个PCR循环有以下三个基本步骤（如图2-9所示）： 1. 变性：是指模板的热变性，双螺旋模版DNA成为单链的DNA 分子。变性往往在94℃~95℃条件下进行。 2. 退火：是指引物和模板在局部形成互补的杂交链的过程。退 火温度比两条寡核苷酸引物的熔解温度低5～10℃。 3. 延伸：在镁离子存在条件下，DNA聚合酶按碱基互补原则， 催化四种脱氧核糖核酸加在引物的3'端，使引物沿5′ →3′ 方向 生成与模版DNA互补的新DNA链。对于Taq DNA聚合酶来说最 适温度一般为72℃～78℃。在最适温度下Taq DNA聚合酶的理 论聚合速度约为150～300 bp。 每一个循环的PCR产物可作为下一个循环的模版。每经过 一个循环，反应体系中的DNA分子数增加一倍，理论上，经过 n次循环，就增加2n倍。

下面为一个典型的PCR反应循环参数设置： 94℃ 5 min 94℃ 30 s X℃* 30 s 72℃ 1 kb/min 72℃ 5 min （* 比两条引物的Tm值低5~10℃ ） 25-35循环

PCR体系 PCR体系包括模板、引物、DNA聚合酶、合成原料与缓冲 体系。 模板序列就是待扩增的DNA序列。一般为单链或双链的 DNA，也可以为单链的cDNA。模板不应混有能与DNA结合的 蛋白质。每个反应中模板的量为1ng～1μg。 引物（primer）也称为寡核苷酸引物。常规的PCR反应需 要两种引物，分别成为5′端引物和3′ 端引物，或称为 正向引物和反向引物。它们作为DNA扩增的起始部分，能 限定待扩增DNA序列的长度。为了保证扩增的特异性和有 效性，引物与模板相匹配部分应至少有18 bp。每个PCR反 应中引物的用量在0.2～1.0 μmol/L内就足够使用。

DNA聚合酶以DNA为模板，以脱氧核糖核酸为底物催化合 成新的DNA。目前商品化的DNA聚合酶有Taq DNA聚合酶和 Pfu DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶分子量为94 kDa，具有5′-3′ 聚合酶 活性，在镁离子存在情况下可催化核苷酸沿5′ -3′ 方向发生聚合反应，理论延伸速度为150～300 bp/s， 但没有3′-5′外切酶活性，对PCR反应中的单核苷酸错 配没有校对能力。 Pfu聚合酶是在嗜热的古核生物火球菌属内发现的，一 类能在活体内进行DNA复制的酶。该酶含有2个蛋白亚基 （P45和P50），分子量约为90kDa。该酶同时具有5'-3' 聚合酶活性和3'-5'外切核酸酶活性，因此在聚合反应 中可纠正错误掺入的碱基，忠实性极高。

PCR反应中DNA合成原料为四种脱氧核苷三磷酸，即dATP、 dTTP、dCTP和dGTP。在新的一个反应体系中，这四种脱 氧核糖核酸的起始浓度应该都相等，如果其中一种的浓度 明显不同于其他的就会诱发错配，并降低新链合成速度。 缓冲液提供PCR反应所必需的合适酸碱度与离子环境。 主要成分有KCl、Tris-HCl和MgCl2，其中Mg2＋的浓度最 重要，它能影响DNA聚合酶的活性，以及模板与PCR产物 的解链温度。反应中Mg2+的浓度为1.5～2.0 mM较为合适。

三、实验操作 1. 在冰水浴中，完成以下PCR体系的配置（0.2mlPCR管）： 2×Taq PCR Master Mix 5µl P1 (10 µM) 1µl P2 (10µM) 1µl 质粒模板1 µl 加无菌水至10µl 加好后，混匀，稍加离心并做好标记（管身与管盖）。

2. 上机，并按照以下参数设置机器程序： 95℃ 2min 94℃ 30s 60℃ 30s 30个循环 72℃ 30s 72℃ 5min 4℃ 10 min 3.配制1%琼脂糖凝胶（详见本专题实验二） 4. 反应结束后，将所有产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进 行鉴定，以100bp DNA Marker（5 µl）作为参照。

四、预期结果

课堂分组讨论 1. 描述一个你理想中的超级生物，并尝试用你学 到的基因重组技术，设计一个创造这个生物的可 能方案。 2. 说说你对转基因食品的看法。