聚合酶链式反应(PCR) (Polymerase Chain Reaction)

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1 聚合酶链式反应(PCR) (Polymerase Chain Reaction)

2 实验目的 掌握PCR技术的原理及技术

3 实验原理 PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。利用PCR技术可在短时间内获得数百万个特异的DNA序列的拷贝。PCR技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。使用PCR法的前提条件是：已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。

4 PCR技术实际上是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1变性：在高温条件下，DNA双链解离形成单链DNA；2退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3延伸：在DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段得到了大量复制，数量可达到106~7个拷贝。

5 PCR技术原理

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9 PCR技术的参数 主要有7个：聚合酶、引物、dNTPs、反应buffer、二价离子、模板、一价离子

10 模 板 单、双链DNA或RNA都可以作为PCR的样品。虽然PCR可以仅用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA），但是为了保证反应的特异性，一般用ng量级的克隆DNA，μg水平的染色体DNA或104拷贝的待扩增片段来做起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有任何蛋白酶，核酸酶，TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，因此DNA样品纯度要尽可能的高。

11 引 物 PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。下列原则有助于引物的合理设计： * 引物长度以15～30个碱基为宜。 * (G＋C)含量最好保持在约40%～60%，应尽量避免数 个嘌呤或嘧啶的连续排列。 * 避免引物内部形成二级结构。 * 两个引物之间不应发生互补。 * 引物浓度不宜偏高。

12         dNTP浓度 高浓度dNTP易产生错误掺入，而浓度过低，势必降低反应产物的产量。PCR常用50－200μmol/L的dNTP，此外，dNTP能与Mg2＋结合，使游离Mg2＋浓度降低。因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2＋浓度。

13 反应buffer 反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH ), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ 。 50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性, 各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

14 Mg2＋浓度 * Mg2＋浓度对反应物的特异性及产量有显著影响。浓度过高，则DNA不易变性；浓度过低，使产物减少。
* 在各种单核苷酸浓度为200μmol/L时，Mg2+为1.5mmol/L较适合。若样品中含EDTA或其他螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。

15 PCR用酶的特性

16 温泉中水生嗜热杆菌

17 TaqDNA聚合酶 Taq多聚酶从嗜热菌分离得到，现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH (室温 ),反应温度75-80℃, 95℃以上失活明显。无3´→5´校读活性，对SDS敏感。 在100μl反应液中，一般加入2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸1000～4000个核苷酸的掺入速度。酶量过多导致产生非特异性产物。

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19 PCR反应参数

20 变性温度与时间 94-95度/1min 可以满足一般要求 变性时间过长易造成酶失活

21 退火温度 一般设定比理论Tm低5℃，但实际上与引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性扩增，此时应调整温度和相应的时间，一般提高温度会增加扩增的特异性。短时间退火有利于产物的特异性。

22 延伸温度和时间 延伸温度一般72度。 延伸时间决定于酶的反应速度和扩增片段长度。

23 实验操作 1 取一个0.2ml eppendorf管，添加以下各种成分反应液 ddH2O 11.8 µl 模板DNA 1 µl
上游引物(2.5µmol/L) µl 下游引物(2.5µmol/L) µl dNTP mixture(2.5mmol/L) µl 10倍×缓冲液+ MgCl µl Taq酶 （2.5 U /ul） µl 总体积 µl 2 稍作离心,将反应管放入PCR仪中。

24 3. 设定反应程序： 94℃条件下使模板DNA预变性3min。 变性 ℃ sec 退火 ℃ sec cycles 延伸 ℃ min 30sec 最后在72℃条件进行延伸7-10min。 4 ℃保温 取5 µl反应液用1%琼脂糖凝胶进行电泳,鉴定PCR产物是否存在以及大小。

25 PCR产物 的琼脂糖凝胶电泳 M 1，2，4，5：PCR产物；3，阴性对照；M，DNA分子量标准（从上向下：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）