中国医科大学 卫生部细胞生物学重点实验室 教育部医学细胞生物学重点实验室 医学基因组学教研室 主讲: 罗阳 教授 分子生物学基本技术课程简介 中国医科大学 卫生部细胞生物学重点实验室 教育部医学细胞生物学重点实验室 医学基因组学教研室 主讲: 罗阳 教授
课程主要讲授内容 分子生物学前沿技术应用 分子生物学基本技术 分子生物学技术在科研设计中的应用（实验课讲授） 基因数据库的应用
主要实验内容(基因组实验室 综合楼15楼) 基因组DNA提取 PCR反应 琼脂糖凝胶电泳 目的基因克隆片段的回收和纯化 目的基因与克隆载体的连接、转化和筛选 RNA的提取 RT-PCR的原理和步骤 Southern印迹杂交 Western印迹杂交
分子生物学前沿技术介绍
讲授内容 LCM(laser capture microdissection) DHPLC（Denaturing High Performance Liquid Chromatography） MLPA（Multiplex ligation-dependent probe amplification） The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
LCM(laser capture microdissection)研究技术体系
DHPLC（Denaturing High Performance Liquid Chromatography）技术分析系统
Demonstration of temperature selection based on melting curve
Three Modes of DHPLC Operation
DHPLC原理 DHPLC技术是利用液相色谱技术， 在高压 闭合液相流路中，将DNA样品自动注入并在 缓冲液的不同梯度变化，在不同分离柱温度 条件下实现对DNA不同的分析；由紫外检测 或荧光检测被分离的DNA样
DHPLC检测流程图 变性高效液相色谱 是一种检测微小突 变的高敏感性，高 精确性和高通量自 动化技术
野生型和突变型PCR产物等体积混合，进行变性和复性形成异源双链，进行DHPLC检测 异源双链由于碱基对不匹配，在部分变性的温度条件下，就会在不匹配的碱基对处部分解链，由于单链DNA所带负电荷减少，结合力弱，因此，在洗脱剂乙氰的作用下异源双链比同源双链先于分离柱上洗脱出来，从而识别变异型 同源双链
图A，患者同正常对照的单峰相比，出现肩峰 B control patient 图B，对异常峰型样品的测序结果 图A，患者同正常对照的单峰相比，出现肩峰
MLPA（Multiplex ligation-dependent probe amplification）结合毛细管电泳技术检测基因突变 CEQ8000遗传分析仪
MLPA技术应用范围 MLPA是一种灵敏度极高的相对定量技术，是利用简单的杂合(hydriation)、连接(ligation)及PCR增幅(PCR amplication)反应，于单一反应管內可同时检测最多40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。 应用于染色体数目异常(Trisomy13、18 & 21)、遗传疾病基因缺失重复(如SMA、DMD基因…等)、基因甲基化检测(如Prader-Willi syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS)、抑癌基因诊断(如Breast cancer、Lung cancer…等)及mRNA分析等。检测探针种类，已超过上百种。
MLPA的技术优势 灵敏度高(High Sensitive) ：MLPA每次反应只需大约20 ng的DNA或10 ng的 RNA即可，为Southern-blots及微阵列(micro-arrays)反应所需的1/100~1/1000，且无须准确定量。 专一性高(Specific) ：利用MLPA可检测序列中单一核苷酸的改变，但需要进一步验证。 再现性高(Reproducible)： 利用40-100 ng之DNA进行检测，其每一个探针的变异系数(Coefficient of variability)仅3-8%。 简单(Simple) ：每一反应只需在同一PCR管內仅行，可获得多达30-40个讯号值，这个反应中已经包含了內控制组，重复组及检测的目的基因，可用于进行反应的监控。 高处理速度(High Throughput) ：MLPA搭配自动化设备，可在三小時内同时处理96个检测。检测从DNA提取、反应至结果分析，仅需兩个工作日。此外，因为所使用的反应条件都相同，可以平行处理不同的检验项目。
MLPA 原理 探针构成 PCR引物X 填充序列 杂交序列 M13-derived oligonucleotide 60-450 bp Synthetic oligonucleotide 50-60 bp PCR引物Y
MLPA 反应过程 1、多对探针同时与靶序列杂交 2、连接酶连接
MLPA 反应过程 3、PCR扩增 4、毛细管电泳检测 通用引物X和Y进行PCR扩增
连续多外显子缺失突变 连续多外显子重复突变
患者和携带者检测结果 患儿 患儿母亲 患儿和患儿母亲的MLPA结果显示相同的重复区域
荧光显微分析系统
实验课教学团队和教学画面