实验四：气相色谱法测定海 洋微藻中的脂肪酸 实验四：气相色谱法测定海 洋微藻中的脂肪酸

一、目的要求 1.掌握气相色谱测定方法 2.海洋微藻中的脂肪酸测定

二、方法概述 1、气相色谱法 气相色谱法（gas chromatography, 简称GC）。由于GC具有高选择性、高分离效率、高灵敏度、分析速度快、样品用量少和应用范围广等特点。已广泛应用于科学研究和现代工业生产等领域。其分离原理是利用试样中各组分在色谱柱中的气相和固定液液相间的分配系数不同，当气化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组分就在其中的两相间进行反复多次（103-106次）的分配（吸附-脱附或溶解-释放），由于固定相对各组分的吸附或溶解能力不同（即保留时间不同），因此各组分在色谱柱的运行速度就不同，经过一定的柱长后，便彼此分离，依序离开色谱柱进入检测器，产生的离子流讯号经放大后，在微处理机上显示出各组分的色谱峰，供分析计算。

2、海洋微藻中脂肪酸的测定 不饱和脂肪酸（PUFA）特别是长链ω3-PUFA如DHA和EPA具有很高的营养价值和药用价值已广为人知。PUFA主要存在于海洋微藻和海洋鱼油中，藻体内EPA和DHA含量远比鱼油高，且微藻还具有生长周期短，繁殖速度快，可塑性强，对营养要素要求简单等特点。因此从微藻中提取PUFA的研究有着现实的意义。

本实验采用简易、快速的样品预处理方法（抽提和酯化一步化）经气相色谱分析，计算出海洋微藻中脂肪酸的含量。

三、仪器设备与试剂 1、仪器 气相色谱仪（SP-3420型，配FID） 色谱工作站（BF-9202） 微量注射器：1μL、20μL 玻璃器皿 H2、压缩空气、高纯氮钢瓶各一瓶

2、试剂 （1）标准脂肪酸 （2）CHCL3-CH3OH混合液（体积比2:1） （3）2mol/L HCL-CH3OH溶液 （4）正己烷（重蒸馏两次）

四、实验步骤 1、样品预处理 实验选用的微藻为球等边金藻（Isochrysis galbaNa）属金藻类，培养液采用F/2配方，光强为4×30W日光灯，光暗比为12：12，温度为26℃。取过滤的冷冻干燥藻体（约10mg），加入一定量的内标物C19:0，连同滤膜放入带螺帽的水解管内，加入2ml CHCl3-CH3OH混合液（体积比为2:1），充N2一分钟后密闭封口，以SCQ-250型超声波清洗器（33KHz，250W）超声萃取30分钟，移出上清液，重复3-4次（超声作用时间可缩短为10分钟），合并萃取液，氮气浓缩吹干后，加入2mol/L HCl-CH3OH溶液，充氮气后密闭（为确保气密性良好，可先用聚四氟乙烯材料密封瓶口后再旋上螺帽拧紧）。于100 ℃水浴中反应40分钟，冷却后用2ml正己烷分两次提取，合并提取液于具塞离心管（由10ml刻度试管吹制而成）中，用氮气吹至20-50l，封好口放入冰箱冷冻保存。测定时取出样品，往具塞离心管中再适量添加正己烷（10-20l），倾斜并缓慢旋转离心管，使管壁上的样品充分溶解混匀后，以1L微量进样器进样检测。

2、毛细管气相色谱分析 （1）色谱条件 气相色谱仪为SP—3420型（北京分析仪器厂），色谱柱为SE—54 弹性石英毛细管色谱柱（Australia International Sales），长为30m，内径为0.22mm，程序升温分四个阶段进行。第一段柱温为50 ℃至120 ℃，以20 ℃/min 的升温速率程序升温，并在120 ℃恒温1 min；第二段柱温为 120 ℃至180 ℃，以6 ℃/min 的升温速率程序升温，并在180 ℃恒温1 min；第三段柱温为 180 ℃至210 ℃，以6 ℃/min 的升温速率程序升温，并在210 ℃恒温10 min；第四段柱温为 210 ℃至280 ℃，以3 ℃/min 的升温速率程序升温，并在280 ℃恒温5min。进样器温度为300 ℃，氢火焰离子化检测器（FID）温度为300 ℃，载气为高纯氮，柱头压为0.42MPa，恒流控制，氮气流量30ml/min,氢气流30ml/min, 空气流量300ml/min,分流比1：18，进样量1l。

（2）色谱操作步骤 详见《SP-3420气相色谱仪操作介绍》，若改用其他色谱仪，则操作步骤应作相应改变。

（3）定性分析和校正因子的计算 定性分析：在同一色谱条件下，用已知的脂肪酸甲酯标样（自制的标准和上海水产大学食品科学技术系混合脂肪酸甲酯标准）色谱峰保留时间与样品脂肪酸甲酯组分色谱峰的保留时间对照进行分析。此外，还参考其他研究者的结果及利用脂肪酸的碳数规律进行综合分析。

RRFis=（Wi × As）/（Ws × Ai） 校正因子的计算：由测定结果，算出每种脂肪酸标准的相对校正因子，计算公式为： RRFis=（Wi × As）/（Ws × Ai） 式中，RRFis —为组分i相对内标S的校正因子； Wi — 该组分的重量； As — 所用内标的峰面积 ； Ws — 所用内标的重量； As — 该组分的峰面积

（4）定量分析 采用内标法测定微藻中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的含量。试样经毛细管气相色谱分离，检测结果由CH9202色谱工作站得到各脂肪酸组分的峰面积，各个脂肪酸组分的含量计算公式如下： 式中Wi% — 试样组分i占样品干重的百分比； W — 该样品的重量； RRFsi,— 组分i相对内标s的相对响应因子； As — 所用内标组分的峰面积； Ws — 所用内标的重量； Ai — 该组分的峰面积

（5）计算微藻中各个脂肪酸的百分含量

5、实验关键 （1）、内标物质的选择：作为内标应满足的条件是能与样品组分峰分离、样品组分性质相似，能经历样品预处理的全过程、样品本身不含内标物组分或者很微量。由于海洋微藻中不含C19：0，因此，本实验选择C19：0作为内标物。 （2）、洁净处理：由于所用微藻样品量小，所含脂肪酸含量相对较低，为保证测定的准确度，应避免有机物沾污。因此，实验所用的玻璃仪器和有关的用具均应进行超声清洗，或者高温灼烧（500℃，2～4h），或者用洗液浸泡洗净后浸泡于1N HNO3中，用前洗净烘干。

（3）、内标法定量：由于样品中加入了内标物，因此，如果在处理过程中样品部分损失或进样量不准确均不会影响定量结果。因为从公式中可知脂肪酸含量与进样量无关，只与所加内标量有关，因此样品水解抽提酯化后无需准确定容。 （4）水解管的密封：样品的抽提酯化这一步要注意水解管的密封，避免溶剂挥发 （本实验采用聚四氟乙烯材料密封，效果良好）。