苏 擘 Department of neurobiology 2016-03 Neurotrophic Factors 苏 擘 Department of neurobiology 2016-03

Neurotrophic receptors Discovery of NGF BDNF, CTNF, GDNF Neurotrophic receptors Trk, CTNFR, GDNFR Neurotrophic factor and diseases

Neurotrophic Factors Neuro – trophic Factor trophé 机体分泌的作用于神经系统，影响神经元和神经胶质细胞生长、分化、存活及其细胞周期的蛋白质分子。 trophé Trophic，来源于古希腊语，意思是，食物、营养品。

Discovery of NGF limb-bud experiment 1934: Victor Hamburger discovered that removal of a limb bud resulted in reduced numbers of sensory and motor neurons in the spinal cord.

Knockdown and 过表达 1949: Victor Hamburger showed that transplantation of a supernumerary limb resulted in increased numbers of sensory and motor neurons in the spinal cord.

Based on his limb-bud experiments, V Based on his limb-bud experiments, V. Hamburger hypothesized that the targets of innervating neurons provide signals that recruit undifferentiated cells to develop into sensory or motor neurons. In 1942, Levi-Montalcini and Levi proposed that target derived signals maintain survival of differentiating neurons. In 1949, Hamburger and Levi-Montalcini repeated the limb bud experiments and found that their results supported the neurotrophic hypothesis. Hamburger, V. and Levi-Montalcini, R. (1949) J. Exp. Zool. 111: 457-502. 支配神经元的靶标分泌某种信号来招募未分化细胞发育成为感觉或运动神经元. Target cells secrete limited amounts of a neurotrophic substance, sensed by specific cell surface receptors. Cells compete for these factors. Those that do not receive sufficient amounts are fated to die.

Neurotrophic hypothesis 神经元的生长必须有来自靶组织的NTF逆向性专一的作用于支配神经元。 在神经元与靶区建立联系时，只有少数神经元可以获得靶区有限的NTF进行分化、存活，其他的神经元则发生凋亡。

What is in the target tissue？？ ~~~Neurotrophic Factors

1954: neurite outgrowth assay 1960: NGF purified – extract Stanley Cohen Rita Levi-Montalcini 第一个神经营养因子----NGF的发现 鸡胚背根神经节组织培养技术 蛇毒和小鼠颌下腺 1986: Levi-Montalcini and Cohen split the Nobel prize for Physiology or Medicine “for their discovery of growth factors” + extract

NGF的结构 由三种不同类型的蛋白质组成的复合物。它对交感神经和感觉神经元的生物学活性取决于其β亚单位。

NGF summary NGF可以介导两类特殊的神经细胞类群~交感神经元和一些感觉神经节细胞; 存在于神经元的靶组织； 相关神经元在NGF剥夺的情况下会死亡；而更多的NGF则可以使更多的神经元存活； ~~~~~~~~神经营养因子的金标准

Neurotrophin, CTNF, GDNF Neurotrophic receptors Discovery of NGF Neurotrophin, CTNF, GDNF Neurotrophic receptors Trk, CTNFR, GDNFR Neurotrophic factor and diseases

Background: Neurotrophins Rita Levi-Montalcini With Hamburger and Cohen, identified NGF in 1950’s Purification of ~2ug brain-derived neurotrophic factor (BDNF) from 3kg pig brains, 1982 Cloning of BDNF, 1989 Hans Thoenen Yves-Alain Barde Only a subset of neurons respond to NGF… 13

NGF: sympathetic neurons and some sensory neurons (CNS neurons do not require NGF for survival) BDNF: NGF-related factor purified in 1982 from pig brain (shares ~50% homolog with NGF) NT-3 and NT-4/5: were obtained by PCR cloning sympathetic neurons All these factors are synthesized as ~250 aa precursors that are processed into 120 aa proteins 14 14

BDNF (brain derived neurotrophic factor) on cortical and hippocampal neurons

BDNF的表达 •BDNF首先在中枢神经系统的神经元中发现，它主要在下丘脑、皮质及前脑基底部的突触部位表达； •BDNF的表达受神经活动及神经递质系统的调节； •BDNF在外周神经受损伤时，也可在斯旺细胞中表达； •BNDF还可在肌肉细胞中表达，当肌肉失神经支 配时其表达上调

NG 节状神经节 SG 脊神经节

神 经 营 养 因 子 受 体 Neurotrophins Trk （R-PTKs） NGF、BDNF、NT-3、NT-4 TrkA 、TrkB、TrkC GDNF family Coupled to Ret GDNF 、neurturin、persephin GFR1、GFR2、 nuknown CNTF family Coupled to Janus kinase（JAK ） CNTF、LIF、IL-6 GP130、CNTFR、LIFR Ephrins Eph (R-PTKs) EGF family ErbB (R-PTKs) EGF, TGF, neuregulns2 Other growth factors R-PTKs Insulin, IGF, FGF, PDGF Interleukins and related cytokines IL-IR coupled to PS/TK, R-PTK IL-1, IL-2, IL-3, IL-5,TNF, TNF Coupled to JAK, Related to p75 TGF family TGF R-PS/TRs Other cytokines Coupled to JAK, R-PTKs Interferons (IFN, , ), m-CSF, gm-CSF Coupled to JAK Chemokines G protein-coupled receotors CC chemokines (IL-8) CC1-CC8R CXC chemokines (MIP, MCP) CXC1-CXC4R CX3C chemokines (neurotactin) Cx3C1R

Neurotrophic Factors NTF Neurotrophins (NT) CNTF (ciliary neurotrophic factor) GDNF (glial-cell-line-derived neurotrophic factor) NGF (nerve growth factor) BDNF (brain-derived neurotrophic factor) NT-3 (neurotrophin-3) NT-4/5 (neurotrophin-4/5) NT-6 (neurotrophin-6) NT-7 (neurotrophin-7) 这是目前已经发现的，具有强的神经营养作用的神经营养因子 19

Ciliary neurotrophic factor，CNTF 1980年，Adler等由E8鸡胚眼中分离到CNTF，分子量20kDa的酸性蛋白，由199aa组成。进化上比较保守，与白血病抑制因子(LIF)、IL-6等构成成血细胞因子(hematopoietic cytokine)超家族 分子以单体形式存在，无糖基化位点，二级结构富含α-螺旋结构，为维持活性所必需 CNTF缺少信号肽序列 在真核细胞中表达的CNTF不能分泌到胞外

Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF 1993年6月，美国Synergen生物技术公司的Lin等发现并克隆了一种新的NTF，由134个氨基酸残基组成，分子量为15kDa 从中脑维持多巴胺能神经元存活的神经胶质细胞株的细胞培养中分离。 GDNF前体有19个AA的信号肽，成熟多肽链中有7个保守的半胱氨酸，活体形式为二聚体 其它GDNFs成员：NTN (neurturin)、PSP (persephin)、ART (artemin)

非神经营养因子肽类生长因子 成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)：aFGF、bFGF 表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF) 胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)：IGF-I，IGF-II 白细胞介素(interleukin，IL)：IL-1，神经白细胞素(neuroleukin) 趋化因子

Molecular Basis of Trophic Interactions First, target tissues synthesize and make available to developing neurons appropriate trophic factors. （靶源性） Second, neurons depend on the availability of some minimum amount of trophic factor for survival, and subsequently for the persistence of appropriate numbers of target connections. （最小剂量依赖） Third, targets produce trophic factors in limited amounts（竞争性） 最小剂量，维持生存及后续联系的维持 23

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Discovery of NGF Neurotrophin, CTNF, GDNF Neurotrophic receptors Trk, CTNFR, GDNFR Neurotrophic factor and diseases

两种信号转导途径 具有酶活性的受体 G蛋白偶联受体 配体激活受体的酶活性，然后由激活的酶去激活产生细胞内信号的效应物。 G蛋白偶联方式，即信号分子同表面受体结合后激活G蛋白，再由G蛋白激活效应物，效应物产生细胞内信号；

Neurotrophins and their receptors CNS development LTP Cardiac development Neurogenesis Vascular stability MAPK PI-3K PLC-γ Survival Differentiation Plasticity

Two kinds of NT Receptor High affinity receptors Trk Low affinity receptors p75NTR

Trk Receptor Trk即原肌球蛋白受体激酶 (tropomyosin receptor kinase)，是原癌基因trk的产物，由原肌球蛋白和酪氨酸激酶融合产生，分子量在120-160kDa的单跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸激酶 (receptor tyrosine kinase，RTK)家族的成员；Trk受体是NT的高亲和力受体

Trk受体的结构特点 配体结合区 （Ligand binding domain）（胞外区）： 跨膜区(TM) Trk受体是NT的高亲和力受体，NT家族成员主要通过Trk受体的自身磷酸化进行信号传导 配体结合区 （Ligand binding domain）（胞外区）： Leucine rich motif (LRM) ：决定配体结合的特异性; IgG- like 结构域：配体结合区; 两个半胱氨酸簇：位于LRM两侧 跨膜区(TM) 胞内区：近膜区(JM)，酪氨酸激酶区(kinase)，羧基尾区(CT)

Trk receptor TrkA (140kDa) TrkB (145kDa) TrkC (145kDa)

Expression pattern Trk受体的分布 TrkA分布在交感、感觉、运动神经元及基底前脑 TrkB分布在整个NS中，在肺、肌肉也有少量表达 TrkC主要在大脑皮质、海马、小脑表达；

TrkA TrkB TrkC n NGF BDNF NT-4 NT-3 34

P P P P Kinase domain P P P P P P

[Ca2+] PIP2 P Shc2 P Grb2 Frs2 P P SOS Ras Gab1/2 P Grb2 P P SH2B P P PI3K P P Raf-1 rAPS PDK-1 DAG IP3 P MEK1/2 PLCγ Apoptotic cascade Akt P P ErK1/2 Egr-1, EIK-1, Stat3 transcript activity 促凋亡基因转录 PKCd [Ca2+] MEK1/2

Signal Transduction of Trk First: Ras Downstream signal PI3K-PKB cell survival MAPK neurite outgrowth and neural differentiation PLC-IP3/DAG activity-dependent plasticity 第一个被激活的信号转导蛋白是小GTP结合蛋白Ras；抑制Ras活性能够阻止大部分交感神经元存活 在NTs依赖的神经元存活中Ras不是直接起作用，而是经过转化和介导NTs启动的多个信号转导途径 PI3K/PKB信号转导途径： 首先在依赖NGF的PC12细胞中被认定，主要的促神经元存活蛋白，可经Ras激活，也可经连接蛋白Shc，Grb-1和Grb-2而激活 PKB： PI3K诱导神经元存活的关键中介因子 PKB的靶分子： 凋亡蛋白Bad，procaspase-9，Forkhead Ras-MEK-MAPK信号转导途径： 通过刺激抗凋亡蛋白的表达发挥作用，介导突起生长及神经元的分化 CREB (cAMP response element binding protein)： 被MAPK磷酸化激活后，转入核内，与CRE结合，激活相关基因的转录 Bcl-2： 抗凋亡蛋白，抑制凋亡，促进细胞分化、再生及损伤后修复 PLC-IP3/DAG IP3-Ca2+/CaM： 可诱导LTP，促进神经突起的生长，调节中枢突触神经递质的受体分型 DAG/Ca2+-PKC： 生长相关蛋白GAP-43 (growth associated protein-43)是PKC的一个底物，它在成熟突触中是神经发育、神经连接再生和突触可塑性的一个决定因子

---- Low affinity receptors p75NTR ---- Low affinity receptors

p75NTR structure 胞外区： 4个重复的富含半胱氨酸的结构域，与配体结合有关 胞内： 无固定的配体诱导的酶激活域，含有6个螺旋结构死亡结构域(death domain，DD) Roux and Barker (2002) Prog Neurobiol 67:203-233

The role of p75NTR p75 enhances ligand binding to Trk receptors p75 enhance ligand specificity to Trk receptors Cell survival and death decisions determined by p75 and Trk 40

Mature NGF Kd = 10-9 M Mature NGF Kd = 10-11 M 41

Signal by p75

Interaction between Trk and p75 Trk受体与p75受体共表达， p75受体增加配体与Trk的结力，TrkA对p75NTR介导的信号通路具有抑制效应 p75NTR介导的凋亡作用只有在细胞内Trk的表达水平很低或不表达的情况时才会出现

Neurotrophic Factors NTF Neurotrophins (NT) CNTF (ciliary neurotrophic factor) GDNF (glial-cell-line-derived neurotrophic factor) NGF (nerve growth factor) BDNF (brain-derived neurotrophic factor) NT-3 (neurotrophin-3) NT-4/5 (neurotrophin-4/5) NT-6 (neurotrophin-6) NT-7 (neurotrophin-7) 这是目前已经发现的，具有强的神经营养作用的神经营养因子 44

NT的主要生物学效应☆ 发育期： 促进神经元的存活，生长和分化成熟 对神经递质的选择作用 诱导神经纤维定向生长 控制神经元存活数量

NGF引导神经纤维的生长方向：趋化作用 Campenot, RB (1977) Local control of neurite development by nerve growth factor. Proc Natl Acad Sci U S A. 74(10):4516-9.

NT 的主要生物学效应 成年期： 维持部分神经元的存活和正常功能 神经元可塑性 神经损伤修复 NT及其受体的表达和分布都明显减少，效应神经元对NT的依赖也明显降低 维持部分神经元的存活和正常功能 神经元可塑性 神经损伤修复

NT的主要生物学效应 非神经系统： NT与其它肽类生长因子一样，也是多功能生长因子，可影响免疫、造血、内分泌、和生殖等系统的功能

CNTF受体及信号传导 CNTFR分子量为52kDa，372aa的糖蛋白 睫状神经营养因子受体α (ciliary neurotrophic factor receptor α，CNTFRα)： 缺乏跨膜的和胞内的结构域，通过糖基磷脂酰肌醇键(glycosylphosphatidylinositol linkage，GPI)锚定在细胞膜 白血病抑制因子受体β (leukemia inhibitory factor receptor β，LIFRβ) gp130：130kDa的糖蛋白(130kDa glycoprotein)

CNTF的主要生物效应 对中枢和周围运动神经元的营养作用 影响非神经组织

GDNF受体及信号传导 受体复合物： 配体结合成分GFRα (GDNF family receptor- α) 和跨膜酪氨酸激酶蛋白Ret 4个亚型，即GFRα1-4，分别与GDNF家族的每一成员结合，GFRα1是GDNF的高亲和力受体； Ret： 原癌基因c-ret的表达产物，为受体酪氨酸激酶超家族的成员，它的胞外区有四个钙粘素样结构域，Ret的胞内区为酪氨酸激酶区

GDNF受体及信号传导 脂质筏(lipid raft)：胆固醇和神经鞘脂类在细胞膜外层聚集的小叶，相应的细胞膜内层富含磷脂、饱和脂肪酸和胆固醇 GFRα受体靠其GPI锚在细胞膜的“ 脂质筏” 中，GDNF 与之结合，招募Ret 移向“ 脂质筏” 中，而后激活下游的信号转导；此信号通路的激活依赖于GFRα和Ret 在“ 脂质筏” 中的共存 激活Ret后，胞内域的Tyr残基磷酸化，便可为靶细胞内多种信号蛋白提供停泊位点，会激活PI3K，MAPK，PLC等不同的信号转导通路，继而产生不同的生物学效应

GDNF的主要生物效应 对多巴胺能神经元的营养支持 促进运动神经元发育、修复损伤后运动神经元 对感觉神经元的营养支持

多受体系统 Castellino and Chao, 1996

NTF的作用模式 逆行信号转导（靶源性的）：经典的NTF作用途径；靶细胞合成NTF，经轴突末端的受体介导，逆行轴突转运到胞体

NTF的作用模式 顺行信号转导：许多靶神经元依赖于传入投射维持其存活，上游神经元通过大分子物质的顺行轴突转运对靶神经元起神经营养作用

NTF的作用模式 NTF的局部作用（旁分泌方式）：靶组织与其支配的神经元共存于同一组织，来自靶合成的NTF作用于临近效应神经元 Target

NTF的作用模式 自分泌作用： 神经元，既合成NTF也有相应受体表达，并对自身的NTF有反应；不能介导神经元与靶之间的相互作用，但可维持神经元直到与靶之间建立突触联系

NTF的作用模式 非分泌方式的NTF： CNTF，aFGF，bFGF缺少信号肽序列，不能分泌到胞外，细胞损伤时才能释放，适应神经再生需要

神经营养因子与疾病

基因敲除动物模型

NTFs及其受体基因敲除小鼠的表型 缺失基因 表型 TrkA 致死性，生后一个月内死亡，感觉及交感神经元缺失 TrkB 致死性，生后即死亡，面神经核和脊髓运动神经元缺失，三叉神经节、背根节缺失 TrkC 致死性，生后一个月内死亡，本体感觉缺失，运动姿势异常 P75NTR 非致死性，可存活至成年，但感觉神经元的一个亚群丢失，周围感觉和交感神经分布缺陷 NGF 非致死性的，但出生后体重增加停滞、长疮、出现自毁倾向，感觉和交感神经节细胞缺失 BDNF 致死性，感觉神经缺陷，颅神经节、外周神经节缺失，最严重的是前庭神经节细胞显著丧失，行为表现为旋转、共济失调和呈弓状姿势 NT-3 致死性，感觉和交感神经元缺失，脊髓传入纤维数目下降，与传递本体觉有关的感受器（肌梭和高尔基腱器）丧失 NT-4/5 正常，10个月内无明显的神经元和表型异常 BDNF+NT-4/5 致死性，与单纯BDNF缺陷相似 CNTF 成体后运动神经元萎缩，数量减少，肌力降低 GDNF、GFRα1或Ret 表现出相同的表型，即肾发育不全和胃肠道神经支配缺失，出生后不久全部死亡

神经营养因子的临床应用前景 神经营养因子的选择活性及临床应用可能 疾病 作用部位 外周神经病 感觉神经元 √ 交感神经元 运动神经元 NGF BDNF NT-3 NT-4/5 CNTF GDNF 外周神经病 感觉神经元 √ 交感神经元 ALS 运动神经元 基底前脑胆碱能神经元 皮质神经元 海马神经元 PD 多巴胺能神经元 HD 纹状体神经元 局部缺血 急性脑脊髓损伤 皮质－脊髓神经元 神经系统肿瘤 神经胶质瘤 成神经细胞瘤

神经营养因子与疾病的治疗 神经损伤与再生 神经退变性疾病 脑缺血性疾病 – 神经元类型 – 年龄 – 损伤部分至胞体的距离 – 阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease) – 帕金森病 脑缺血性疾病 – 脑栓塞 NGF NGF: 可改善由已二酮和丙烯酰胺造成的中毒性周围神经病所致的肢体运动功能障碍

神经营养因子的临床应用前景 神经营养素为蛋白质，难以通过血脑屏障，故不能直接通过全身给药治疗中枢神经系统疾病 脑内给药 利用蛋白修饰增加穿过血脑屏障的能力 利用基因工程手段增加NTF的功能，扩大应用范围 多种NTF联用 寻找调控NTF及其受体表达或启动信号转导的小分子物质

遗留的问题 在CNS中还没有发现神经元存活数目与NT的联系 敲除NT 或者Trk受体，可以发现引起可预测的PNS的缺陷，但对CNS的结构和功能的影响非常小。

本章重点 什么是神经营养因子？主要的几种神经营养因子 神经营养素的受体类型。 神经营养因子应用于临床要解决的问题。

谢谢！！