单分子测序技术对于未来基因组学研究的影响 范文竹 10808066 2009年5月13日
背景 自从20世纪90年代中期基因组学研究开始，人们就热衷于对大量的真原核生物进行全基因组测序。 大规模基因组重测序、特定区域测序、宏基因组和泛基因组测序，以及个体基因组学，这些基因组学研究的发展则需要更快速度和更低成本的测序技术。 到目前为止，只有几个个体的基因组被完全测序完成，只有Craig Venter 和 James Watson的基因组序列已经发布。 为了满足这种日益增长的需求，几种非Sanger的超高通量测序系统已于2007年面世。
第二代测序方法 1 文库制备 2 产生DNA簇 3 测序 4 数据分析
第二代测序方法 优点： 可扩展的超高通量 需要样品量少 简单、快速、自动化 新颖的测序化学技术 高产量的有效数据 单个或配对末端支持 DNA 分析支持 缺点： 仍旧依靠于聚合酶链式反应，有可能在扩增过程中产生错误 DNA合成的非同时性造成DNA链的相移 读取长度的限制，使其在对未知基因组进行从头测序的应用受 到限制，这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850 碱基) 的协助。
第二代测序方法 应用： DNA 水平 a. 基因组测序及注释 b. 定向基因区域重复测序 – 判定和发现新的基因多态性（如 SNP） c. 大规模筛查基因突变和基因多态性 d. 利用SNP 进行表型相关性的研究 e. 基因组甲基化分析 RNA 水平 a. 全基因组广谱基因表达研究 b. 小RNA 扫描，定量，和鉴定蛋白水平 a. 核酸和蛋白相互作用及定位研究（ 如ChIp-Seq 研究）
第三代测序方法 单分子测序方法早在1989年Keller等人就已 经提出，经过几种不同方法的实验室测试。 单分子测序技术（SMS）不依赖于聚合酶 链式反应，因此可以克服第二代测序的缺 陷。 如扫描探针显微法、外切酶测序法、合成 测序法（SBS）以及其他几种方法
第三代测序方法 1 核酸外切酶测序法 2 合成测序法 3 纳米孔测序法 4 透射电镜测序技术
核酸外切酶测序法
合成测序法 真实单分子测序法（tSMS) 能量共振转移测序法（FRET） SMRT 测序法（SMRT） 合成测序法的总原理，主要就是DNA合成过程中加入的建基可被检测到，催灭后假如第二种剪辑
合成测序法-tSMS pA连接上的，循环，问题
合成测序法-FRET 能量共振转移 聚合酶-供体荧光，四种碱基带有四种不同的受体荧光，反应发生后带有荧光的焦磷酸集团自动脱落，脚上面犯法优化了，不用加反应剂，四种核苷酸同时加入
合成测序法-SMRT Single Molecule Real-Time SMRT芯片，空中有ZMWs一种纳米结构，2*十的﹣23此方立方米内有荧光检测光束，检测时间微秒级，停留时间毫秒级，荧光集团在磷酸集团上，脱落后及扩散
纳米孔测序技术 杂交辅助的纳米孔测序法 (HANS) 寡聚物辅助的纳米孔测序法 非常薄的有纳米孔径的1.5到2纳米，单恋DNA放置再摸一侧，通电带负电的DNA便会移动通过纳米孔，改变膜的电导，反过来影响电流，这种PA记得改变可有一种电流会理测得，非变绿极高，一个剪辑的差异也可测得，仍处于理论验证阶段，另一个五年。最大的障碍是DNA通过的速率太快，以致于不能分辨每一个剪辑
透射电镜测序技术 以单链线性DNA为模板，以三种重元素标记，一种不标记的脱氧核苷酸为原料，合成其互补链，经透射电镜（TEM）检测，则可见重元素标记，其互补链则可由点的大小和强度被分辨出来
第二三代测序技术比较
技术瓶颈 可读序列短 高错误率 产生相接末段 大量数据的管理困难
未来与展望 SMS是一种新兴的有潜力的测序技术，其优缺点只有在被大量研究者使用时才会完全暴露。
Thank You！