单分子测序技术对于未来基因组学研究的影响

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单分子测序技术对于未来基因组学研究的影响 范文竹 10808066 2009年5月13日

背景 自从20世纪90年代中期基因组学研究开始,人们就热衷于对大量的真原核生物进行全基因组测序。 大规模基因组重测序、特定区域测序、宏基因组和泛基因组测序,以及个体基因组学,这些基因组学研究的发展则需要更快速度和更低成本的测序技术。 到目前为止,只有几个个体的基因组被完全测序完成,只有Craig Venter 和 James Watson的基因组序列已经发布。 为了满足这种日益增长的需求,几种非Sanger的超高通量测序系统已于2007年面世。

第二代测序方法 1 文库制备 2 产生DNA簇 3 测序 4 数据分析

第二代测序方法 优点: 可扩展的超高通量 需要样品量少 简单、快速、自动化 新颖的测序化学技术 高产量的有效数据 单个或配对末端支持 DNA 分析支持 缺点: 仍旧依靠于聚合酶链式反应,有可能在扩增过程中产生错误 DNA合成的非同时性造成DNA链的相移 读取长度的限制,使其在对未知基因组进行从头测序的应用受 到限制,这部分工作仍然需要传统测序(读取长度达到850 碱基) 的协助。

第二代测序方法 应用: DNA 水平 a. 基因组测序及注释 b. 定向基因区域重复测序 – 判定和发现新的基因多态性(如 SNP) c. 大规模筛查基因突变和基因多态性 d. 利用SNP 进行表型相关性的研究 e. 基因组甲基化分析 RNA 水平 a. 全基因组广谱基因表达研究 b. 小RNA 扫描,定量,和鉴定蛋白水平 a. 核酸和蛋白相互作用及定位研究( 如ChIp-Seq 研究)

第三代测序方法 单分子测序方法早在1989年Keller等人就已 经提出,经过几种不同方法的实验室测试。 单分子测序技术(SMS)不依赖于聚合酶 链式反应,因此可以克服第二代测序的缺 陷。 如扫描探针显微法、外切酶测序法、合成 测序法(SBS)以及其他几种方法

第三代测序方法 1 核酸外切酶测序法 2 合成测序法 3 纳米孔测序法 4 透射电镜测序技术

核酸外切酶测序法

合成测序法 真实单分子测序法(tSMS) 能量共振转移测序法(FRET) SMRT 测序法(SMRT) 合成测序法的总原理,主要就是DNA合成过程中加入的建基可被检测到,催灭后假如第二种剪辑

合成测序法-tSMS pA连接上的,循环,问题

合成测序法-FRET 能量共振转移 聚合酶-供体荧光,四种碱基带有四种不同的受体荧光,反应发生后带有荧光的焦磷酸集团自动脱落,脚上面犯法优化了,不用加反应剂,四种核苷酸同时加入

合成测序法-SMRT Single Molecule Real-Time SMRT芯片,空中有ZMWs一种纳米结构,2*十的﹣23此方立方米内有荧光检测光束,检测时间微秒级,停留时间毫秒级,荧光集团在磷酸集团上,脱落后及扩散

纳米孔测序技术 杂交辅助的纳米孔测序法 (HANS) 寡聚物辅助的纳米孔测序法 非常薄的有纳米孔径的1.5到2纳米,单恋DNA放置再摸一侧,通电带负电的DNA便会移动通过纳米孔,改变膜的电导,反过来影响电流,这种PA记得改变可有一种电流会理测得,非变绿极高,一个剪辑的差异也可测得,仍处于理论验证阶段,另一个五年。最大的障碍是DNA通过的速率太快,以致于不能分辨每一个剪辑

透射电镜测序技术 以单链线性DNA为模板,以三种重元素标记,一种不标记的脱氧核苷酸为原料,合成其互补链,经透射电镜(TEM)检测,则可见重元素标记,其互补链则可由点的大小和强度被分辨出来

第二三代测序技术比较

技术瓶颈 可读序列短 高错误率 产生相接末段 大量数据的管理困难

未来与展望 SMS是一种新兴的有潜力的测序技术,其优缺点只有在被大量研究者使用时才会完全暴露。

Thank You!