胡亮 技术支持 北京元业伯乐科技发展有限公司 定量PCR实验流程与注意事项 胡亮 技术支持 北京元业伯乐科技发展有限公司

实验流程 RNA提取 qPCR实验 数据处理 RNA定量 反转录(RT) qPCR实验设计 DNA提取 qPCR预实验 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit AquaPure RNA 分离试剂盒: 无需接触有毒的苯、胍或氯仿等试剂 高速度— 从细胞、组织或血液到纯化的RNA 只需大约30 min 应用广泛的操作流程— 液相操作流程适合范围极广的应用领域 2

DNA模板 模板的来源影响了引物与模板的结合 在优化实验条件时应考虑到未来实验中要用到的模板浓度

影响DNA模板的因素 样品的准备 保证样品的质量与均一性 模板的制备 RNA提取、含量、质量 反转录 引物与探针的优化 Verify primer and probe specificity Maximize individual PCR efficiencies Equalize individual PCR efficiencies. FYI on his probes and primer sets for these experiments: All primer pairs were designed to anneal at ~59 ºC All probes were designed to anneal at ~68 ºC All primer pairs were designed to generate a single fragment of 80-176 bp

样品来源 模板可以是gDNA、cDNA、质粒、PCR产物；RNA需要反转录成cDNA RNA可以直接定量，前提是RT的效率一致􀂋 DNA纯度：OD260/OD280=1.8，可以在1.6 - 2.0之间􀂋 DNA用量：0.1 ng -1 ug，最好10-100 ng/rxn􀂋 DNA处理：基因组DNA及质粒DNA RNA纯度：OD260/OD280=2.0􀂋 RNA用量：60 ng–2 ug/ RT-rxn；􀂋 RNA处理：DNA酶处理 cDNA用量：1-100 ng RNA反转录所得cDNA加1 uL/rxn􀂋 注意：100 uL的反转录体系最多可以反转录2ug 总RNA；如果>2 ug，分成几管 100mg组织－1ml Trizol 反转录10ul体系，而后取2ul稀释至20ul，加样1ul 5

DNA模板 基因组DNA (完整的高分子量的DNA) 质粒DNA cDNA 限制性酶切时不要切掉扩增区域 若质粒扩增有问题可在酶切使质粒线性化， 但酶切位点不能位于扩增序列中 cDNA RNA中不能有基因组DNA污染 （反转录前用RNAse-free DNase处理） 引物设计跨内含子，以避免基因组DNA扩增 确保RT reaction的效率和重复性

实验流程 RNA提取 qPCR实验 数据处理 RNA定量 反转录(RT) qPCR实验设计 DNA提取 qPCR预实验 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit AquaPure RNA 分离试剂盒: 无需接触有毒的苯、胍或氯仿等试剂 高速度— 从细胞、组织或血液到纯化的RNA 只需大约30 min 应用广泛的操作流程— 液相操作流程适合范围极广的应用领域 7

qPCR实验设计需要考虑的问题 绝对定量与相对定量 使用SYBR或是Taqman探针（单重或多重PCR） 样品与对照组的设置 标准品的选择 看家基因的选择 引物与探针的设计 扩增子的设计 实验循环条件的设计

多重PCR技术问题 1、引物及探针相互干扰问题 F R Q F R Q R F R Q

多重PCR技术问题 2、共用资源的相互竞争 F R Q F R Q R Q

多重PCR需要考虑的问题 检验各引物对与探针的特异性 所有的引物对Tm值应当一致 所有的探针Tm值应当一致 所有的扩增子长度应尽可能接近 多重PCR与单PCR相互印证 Verify primer and probe specificity Maximize individual PCR efficiencies Equalize individual PCR efficiencies. FYI on his probes and primer sets for these experiments: All primer pairs were designed to anneal at ~59 ºC All probes were designed to anneal at ~68 ºC All primer pairs were designed to generate a single fragment of 80-176 bp

qPCR实验设计需要考虑的问题 绝对定量与相对定量 使用SYBR或是Taqman探针（单重或多重PCR） 样品与对照组的设置 标准品的选择 看家基因的选择 引物与探针的设计 扩增子的设计 实验循环条件的设计

实验中不同样品的作用 目标基因： 未知样品 生成标准曲线： 标准品梯度 监控系统故障： 阳性对照􀂾 监控污染： 阴性对照 基因组对照􀂾 目标基因： 未知样品 生成标准曲线： 标准品梯度 监控系统故障： 阳性对照􀂾 监控污染： 阴性对照 基因组对照􀂾 校准生物学误差：看家基因􀂾 降低其余误差： 样品重复实验

重复 定量PCR中样本（包括对照及标准品）一般需要3个重复 一般重复间允许的差异≤0.5Ct（理想的状态≤0.25Ct） 理想的重复: 准备反应体系master mix, 包括样本 使用热启动taq酶，避免非特异产物的扩增 分装mix时使用一个枪头 充分旋涡震荡5秒以上

对照 实验中要设立阴性对照和阳性对照 对照和样品都要设重复 阳性对照 阴性对照 结果可预知的样品 证明实验体系正常 防止PCR抑制造成的假阴性（特别是病原体 +/- 检测） 阴性对照 通常是无模板的对照 检查污染 进行反转录PCR，用未转录的对照来防止基因组DNA的污染

qPCR实验设计需要考虑的问题 绝对定量与相对定量 使用SYBR或是Taqman探针 对照组的设置 标准品的选择与制备 看家基因的选择 引物与探针的设计 扩增子的设计 实验循环条件的设计

标准品 目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系 不要求： 􀂃数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA 􀂃可以使用相同的DNA（目标基因质粒，目标基因CDNA） 􀂃也可以使用不同的：PCR产物、质粒、病毒、人工合成片段…… 要求： 􀂃5点以上 􀂃浓度已知 􀂃PCR效率一致，且接近100% 仪器一致 反应条件一致：循环参数、同一次实验 试剂质量一致：模板、引物和探针Tm值、酶及缓冲液 As a general rule, variation should be less than 0.5 Ct (ideally less than 0.25 Ct) 17

梯度稀释方法 选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释􀂋 覆盖全部样品浓度区间􀂋 108 105 106 107 104 103 102 101 Each tube contains 90ml H20 Each tube remove 10ml sample vortex r 的绝对值>0.990或 R2 值>0.980。 10倍连续梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 切不可由标准品I分别加不同体积的稀释缓冲液 直接得到标准品ii、iii、iv、v 18

标准品 用于做标准品的模板DNA包括： 标准品应当独立定量 含有目的基因的质粒 PCR产物 合成的寡核苷酸 阳性对照样品 对于基因表达研究可使用: cDNA 标准品应当独立定量

标准品 标准曲线至少包括五个不同的浓度 未知样品应当位于标准曲线的范围内 使用标准曲线定量未知样品的前提是标准品 和未知样品的扩增效率相同。需要验证。 对未知样品进行绝对定量必须使用同批次的 标准品

qPCR实验设计需要考虑的问题 绝对定量与相对定量 使用SYBR或是Taqman探针 对照组的设置 标准品的选择 看家基因的选择 引物与探针的设计 扩增子的设计 实验循环条件的设计

管家基因的选择标准 在所有待测样品中，内对照(Endogenous Control)的表达量都恒定不变 注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依赖的、或者处理方式依赖的 多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高 因为生物系统的复杂性，使用多个内参基因（Vandesompele）对于准确定量可能是必须的。 http://medgen.ugent.be/~ 常用的内对照有18S rRNA、β-actin、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)等 作用：监控PCR抑制物、DNA/RNA提取的损失、操作误差等对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行修正。 22

qPCR实验设计需要考虑的问题 绝对定量与相对定量 使用SYBR或是Taqman探针 对照组的设置 标准品的选择 看家基因的选择 引物与探针的设计 扩增子的设计 实验循环条件的设计

好的引物及扩增子设计 提高扩增反应的效率 提高反应的特异性、减少非特异性扩增 提高产量和灵敏度 减少多重PCR的交叉影响 准确、可重复的结果

引物设计 避免二级结构 GC含量控制在50-60% 连续的G或C不超过3个碱基 5’末端不含G These are the general rules for primer design. The main difference from primer design for standard PCR applications is designing for primer binding to generate a small amplicon. In general, two themes govern the rules of primer design. - Maximize potential reaction efficiency by minimizing target size and avoiding regions of predicted secondary structure. - Increase the overall specificity of your primer set by reducing the potential for GC clamps within your primer sequences. Also, the overall GC content is a guideline but not a hard-fast rule. AT-rich sequences can still be evaluated by real-time PCR.

通过引物设计提高特异性 BLAST 使用SYBR Green方法时考虑到以后采用探针法 进行多重PCR的可能 测试多个引物对 选择无引物二聚体且扩增效率最高的引物对 Plan ahead when you are designing your assay. You may be using SYBR Green I today, but you may want to use probes and multiplex tomorrow. If you validate your assay using SYBR Green, you can have confidence in your probe assay. It must be pointed out that TaqMan assays also require optimization and validation. The fluorescence from TaqMan PCR should be target specific, but the PCR specificity should also be checked using melting curve analysis or gel electrophoresis. This example is shown in the next slide.

探针法 首先设计引物，用SYBR Green验证, 然后设计探针 探针法只能保证荧光信号的特异性， 但不能检验反应的特异性 选择荧光素时考虑多重PCR的需要

TaqMan探针的设计 探针的Tm应比引物高约10℃ 探针的Tm：68-70℃ 探针的G/C含量：30-70% 5’末端不含G 避免探针的二级结构 避免与引物形成二聚体

qPCR实验设计需要考虑的问题 绝对定量与相对定量 使用SYBR或是Taqman探针 对照组的设置 标准品的选择 看家基因的选择 引物与探针的设计 扩增子的设计 实验循环条件的设计

扩增子设计 扩增子长度：80-250bp 避免二级结构 利用mFold 分析二级结构 避免引物位于stem loop结构中 http://bioinfo.math.rpi.edu/mfold/applications 避免引物位于stem loop结构中 These are general guidelines to be followed for amplicon design. The length of the amplicon will depend in part on the detection chemistry being employed, but most amplicons are designed to be short to promote better reaction efficiency. In the next few slides, we will point out the importance of limiting secondary structure of the amplicon and highlight the effectiveness of Beacon Designer software for designing assays.

扩增子二级结构 http://bioinfo.math.rpi.edu/mfold/applications Bad location for primers Good location for primers Two different assays were designed for the same sequence using two different software packages. The secondary structure of the amplicon was modeled in the web site listed. At annealing temperature the above structures will be formed. Note that the first figure contains stem loop structures at the location where the 3’ primer should be annealing. This results in less efficient amplification. At first, looking at probe and primer sequences alone, it may seem that they design equally. Yet, programs design in different parts of the sequence and this slide highlights that Beacon Designer excels in placing probe and primer sequences where there is significantly less secondary structure.

引物位置 Primer A: h = 66.3 % Primer B: h = 95.8 % 110 1 Primer A Primer B Reverse Primer B Primer B: h = 95.8 % The efficiency of this reaction is less than 70% because the reverse primer anneals at a point of hairpin-loop structure in the amplicon. Note that replicates group poorly at low starting concentrations. A common observation of real-time researchers (especially those who do not validate using standard curves) is that they do not trust CT values higher that 30. At these values their assays are not reproducible. In many cases the problem is low efficiency reactions which were designed without the tools necessary to evaluate this characteristic. By moving the reverse primer to this location, you eliminate the secondary structure and increase the efficiency of the reaction to greater than 95%. Note that it is the secondary structure in the amplicon that is the concern. The stem loop structure indicated above is certainly in the initial template but this only effects the first 2 rounds of amplification. The vast majority of the interactions that occur to produce the results of the experiment do not involve the stem loop structure. Reverse Primer A Forward Primer 1 110

实验流程 RNA提取 qPCR实验 数据处理 RNA定量 反转录(RT) qPCR实验设计 DNA提取 qPCR预实验 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit AquaPure RNA 分离试剂盒: 无需接触有毒的苯、胍或氯仿等试剂 高速度— 从细胞、组织或血液到纯化的RNA 只需大约30 min 应用广泛的操作流程— 液相操作流程适合范围极广的应用领域 33

如何检验实验的设计是否合适 利用SYBR Green I 进行定量试验检测下列指标 利用琼脂糖凝胶电泳检测下列指标 扩增效率 重复性 特异性（结合融解曲线分析） 利用琼脂糖凝胶电泳检测下列指标 特异性

认真严格的实验操作 实验室环境和实验器具保持干净 戴手套操作、勤换手套 使用带螺纹的管子 使用经过校准的PCR专用加样器 使用带有滤芯的枪头 使用热启动酶 定期用紫外灯照射实验区，电泳区域与样本制备区隔离

认真严格的实验操作 除模板外其他成分预混，用涡旋振荡器混匀 在PCR管中加样时先加模板再加MIX 进行定量PCR前对样品进行离心，除掉气泡 设置无模板的对照 设置重复样本——至少三个重复 PCR管或PCR板要密封好 尽可能使用大的加样体积 (>5ul)

Poor Technique Good Technique 相同的试剂，不同人操作 Cycle Cycle Same experiment performed the same day by experienced and unexperienced individual. All reagents were exactly the same. Good Technique Poor Technique

实验流程 RNA提取 qPCR实验 数据处理 RNA定量 反转录(RT) qPCR实验设计 DNA提取 qPCR预实验 Aurum Total RNA kit iScript cDNA Synthesis Kit AquaPure RNA 分离试剂盒: 无需接触有毒的苯、胍或氯仿等试剂 高速度— 从细胞、组织或血液到纯化的RNA 只需大约30 min 应用广泛的操作流程— 液相操作流程适合范围极广的应用领域 38

要清楚数据是如何被分析的，要知道数据处理方法的前提假设。 例如使用2-DDCt方法的前提是目的基因和内参照基因的扩增效率都是100% 要验证这些假设

感谢各位光临！