Leica TCS SP Confocal Spectral Microscope 雷射掃描共軛焦分光光譜顯微鏡 簡易使用流程參考 因為樣品的差異性頗高, 所以, 本操作流程 僅是提供一套簡易流程, 供使用人員參考. 然而, 最佳的使用控制調整, 應該以您個人 使用中的樣品為唯一準則. 美嘉儀器 – 共軛焦小組 編製 TEL : 02-2808-1452 / E-mail : confocal@major.com.tw 緊急聯絡 : 0933-267 613 ( 24 hours on-call )

使用前, 請自問 : 樣品於顯微鏡下, 聚焦了嗎 ? 螢光染劑是甚麼 ? 其最大激發光譜波長 ? ( Excitation ) 其最大 釋放光譜波長 ? ( Emission, Detection ) 螢光染劑容易漂白嗎 ? 樣品於顯微鏡下, 聚焦了嗎 ?

B. 選用螢光感測光譜設定 … [ Acquire ] … [ Beam ] C. 設定基本掃描參數 .. [ Obj ] .. [ Mode ] .. [ Format ] .. [ Speed ] D. 設定 Panel Box 的調控參數 與 配置位置 E. 依序執行影像擷取功能 Continuous scan ( 連續掃描 _ 取得最佳調控 ) Single scan ( 單一 1D 影像擷取 ) Series scan ( 連續斷層 3D 影像擷取 ) F. 儲存結果 與 進階影像處理, 量測, 編輯, 輸出列印. 可儲取個人的控制 7 個 Panel

啟動軟體之前的注意事項 : 6. 轉至 UV-Scanner 位置 ( 如有 UV-laser 裝置 ) 4. 往外拉至 TCS 如果已完成一般顯微鏡的鏡檢及聚焦, 請依序執下列操作 : 6. 轉至 UV-Scanner 位置 ( 如有 UV-laser 裝置 ) 4. 往外拉至 TCS 1. 先開 Scanner 2. 再開 PC 5. 轉至 “ 4 ” Scanner 的位置 3. 開啟雷射電源, Ar 雷射調整旋鈕 轉到 12 點鐘位置 * UV laser 請由專人開啟

啟動軟體 啟動軟體 ( 以滑鼠點選, 按二下 ) 電腦會自動起始化 掃描過程中, 請勿觸碰顯微鏡 及 防震桌 !

Start dialog 選取 由於系統啟動後, 掃描器會自動校準, 顯微鏡的 Z-掃描台會自動歸零, 而焦距有所位移. 所以, 有時, 必須再看一下顯微鏡下的樣品, 是否有在聚焦位置 ?

注意 : 請留意每一個小 [ 圖示區 ] 的位置, 因為底下的控制版面是 可更改設定與移動的. 所以, 使用人員必須先行清楚每一 請留意每一個小 [ 圖示區 ] 的位置, 因為底下的控制版面是 可更改設定與移動的. 所以, 使用人員必須先行清楚每一 圖示區的放置位置. ( 未經允許, 請勿擅自更改圖示區的配置 ) 圖示區 : Control Button ( 可編輯, 可認意組配安置 ….. 您現在使用中的圖示區安排可能與本圖示配置不同 )

Control Panel 的位置與參數設定 檔案管理 ( 存取 ) 滑鼠右鍵按一下, 可開啟左邊的 影像處理視窗 Control Panel 有 7 個對應位置, 針對每一個 對應位置, 設定所要使用的控置參數 以滑鼠按一下, 即可得到參數選單. PMT Gain 1/2/3/4 Z-focus Zoom Pinhole

選取 [ Acquire ].. [ Beam ] L : U : 選取應用設定 設定光路及螢光感測光譜範圍 代表原廠設定 無法變更設定 代表使用者設定 可變更設定 選取應用設定 設定光路及螢光感測光譜範圍 如果要自行設定條件及一個專屬應用檔名 則, 僅按 SAVE 後, 輸入檔明即可.

參數設定 Active 光譜範圍調整 Active 選取 Glow ( O ) 光路徑 分光鏡 可自行調整光譜範圍 或 選用 PMT. 如果應用為 綠色 及 紅色 兩種顯色 光路徑 分光鏡 可見光雷射調控 ( AOTF ) 選用雷射波長 調整雷射強度 螢光釋放波長 雷射激發波長 光譜範圍調整 可自行調整光譜範圍 或 選用 PMT. 穿透光影像 感測用 PMT Glow, Glow (Over) 訊號感測超過閥值, 會警示與變藍色 Glow (Under), Glow (Over & Under) Active 表示選用螢光 感測 PMT 選取 Glow ( O )

基本掃描參數設定 1. 選取 XYZ 掃描模式 4. 選取 400 3. 選 512 x 512 7. 選取 8 bits 在完成 [ Acquire ] – [ Beam ] 設定後 : 選取 單向掃描 ( Unidirection ) 如果按下滑鼠, 則為雙向掃描 1. 選取 XYZ 掃描模式 5. 選 Airy 1 4. 選取 400 Medium 3. 選 512 x 512 7. 選取 8 bits 6. Zoom 選取 1 2. 選取所使用中的物鏡 如 PL-APO 63x / 1.32 Oil 完成上列基本設定後, 即可開始執行連續掃描 ( Continuous scan )

連續掃描 ( Continuous scan ) 移動掃描中的影像 快速調整 PMT 感測 的 gain, 以藍色顯示 出現一點點為最佳狀態 此位置應設為 “ Z “ 軸調控. 調整聚焦, 讓影像清析 小小技巧 : 除了 PMT 及 Z-focus 調整外, 也可調整雷射強度, 光譜感測範圍, 或 Pinhole 大小, 或改變 PMT 的 Offset. 如果, 在經過上列的基本調整後, 已可取得不錯的影像, 則可再按一下 [ Continuous ] scan , 即可取得影像, 供儲存. 如果, 影像仍然有雜訊或不夠銳比, 則可考慮再使用平均 ( average ) 的擷取處理. Averaging 1 – 64 範圍, 可供選取使用, 供影像擷取的平均化, 以消除雜訊 ( 但, 易光漂白的染劑不適用此法 )

影像調控 顯示視窗 1 ch1 ch2 Overlay ch3 ch4 如果應用為 3-ch. ( FITC / TRITC / Cy5) 調控參數即時顯示 1 按一下滑鼠右鍵, 可更改顯示顏色 Overlay ch3 ch4 如果是取得 series 影像, 可利用此鈕, 播放連續動態影像

Mode : 影像擷取掃描模式 Mode xyz 功能解說 An image stack is recorded from xy-sections in z-direction. ( 最為常用的掃描模式 ) xzy An image stack is recorded from xz-sections in y-direction. xt A line is recorded several successive times. xyt An xy-section is recorded several successive times. xzt An xz-section is recorded several successive times. xyzt An image stack is recorded from xy-sections in z-direction several successive times. xyl An xy-section is recorded at different wavelengths. ( 波長掃描 ) xzl An xz-section is recorded at different wavelengths.

Speed 雷射掃描速率的選取 點選 400 lines / sec. [ Medium ] 掃描速率 Uni-Direction ( 單向掃描 ) Bi-Direction ( 雙向掃描 ) 須配合 Phase 調整 200 image lines / sec. 400 image lines / sec. 800 image lines / sec 800 image lines / sec. 1600 image lines / sec 1000 image lines / sec. 2000 image lines / sec 點選 400 lines / sec. [ Medium ] 掃描速率 512 x 512 尺吋, 400 lines/sec, 可得到較佳的 訊號與雜訊比 ( signal-to-noise ratio ) 選 800 及1000 的高速掃描, Zoom 比會自動設為 2 及 4 依照樣品與螢光染劑特性 ( 如, 是否極易造成光漂白 ), 以決定掃描速率 掃描速率愈快, 雷射光點的 Dwell time 愈短. 如果掃描較為慢速, 其 Dwell time 愈長, 則 PMT 可感測愈多的螢光, 其螢光訊號愈強.

Phase 高速雙向掃描速率的相位修正 單向掃描 雙向掃描 如果選用雙向掃描, 則選用 Phase 旋鈕, 調整相位至重疊為止. 例如 : 左右調整至影像清晰

Single Scan / 單一影像擷取 選取 ( 可配合 Line average 或 Averaging _ Frame by Frame )

3D series / 連續斷層影像擷取 決定光切數目 1. 連續掃描時, 調 Z-焦距, 找出最上點, 在 Begin 按一下, 可配合 Averaging 以消除雜訊 每一切片的影像要 做平均處理嗎 ? 1. 連續掃描時, 調 Z-焦距, 找出最上點, 在 Begin 按一下, 2. 再找出最下點, 然後在 End 按一下. 3. 最後又於 連續掃描框內按一下. 4. 再選切片數目, 平均數目, 按 Series 光切掃描.

範例 : 玻片 : 0.17 mm 浸漬油 : r =1.5180 Beam : L : FITC / TRITC Laser : AOTF 調控約至 70% 處 Objective : PL-APO 63x/1.32 Oil Mode : XYZ Format : 512 x 512 Speed : 400 ( medium ) Scan : Unidriection ( 不用按滑鼠 ) Zoom : 1 ( 原廠起始設定 ) Pinhole : Airy 1 ( 原廠起始設定 ) Average : 8 ( 原廠起始設定 ) PMT 1 / 2 gain : 約為 700 左右 顯示 : Glow ( O ) Overlay 顯示 : RGB Continuous scan

Advanced Lambda Scanning 波長掃描 Timelapse / 長時間掃描記錄 XY-Stage / 選配載物檯掃描 Storage Concept

Time-Series 1/4 Line-Mode „xt“ Frame-Mode „xyt“ Stack-Mode „xyzt“

Time-Series 2/4 Line-Mode „xt“ Configuration

Time-Series 3/4 Stack-Mode „xyt“ Configuration

Time-Series 4/4 Stack-Mode „xyzt“ Configuration

XY-Stage-Applications Mark and Find Large Field image scanning Biochip-Analysis

Lamda-Scan 1/3 Select the begin position W0 於此處, 按二下滑鼠, 可輸入起始波長的範圍, 如 500 – 520 nm Select the begin position W0

Lamda-Scan 2/3 Select the end position W1 於此處, 按二下滑鼠, 可輸入截止波長的範圍, 如 670 - 690 nm Select the end position W1

Lamda-Scan 3/3 Calculate the number of slices 決定您的掃描間距 如 每 Step 為 40 nm 完成波長設定後, 再按一下 [ Series ] 即可開始掃描

Lamda-Scan 4/4 Quantify the resulting image 任意選定所要的區域, 作光譜量測