HBV 的变异及其耐药的诊治 上海瑞金医院 陆志檬教授

变异是病毒重要生物学特征之一 慢性HBV感染者体内每天可产生1011~13个病毒体 复制过程中DNA多聚酶可发生错误导致病毒DNA中出现核苷错误配对 HBV DNA每个复制循环中每10,000个碱基对可发生1个核苷错误，因而形成HBV突变株： 可能改变了宿主对病毒的免疫反应 可能增强了病毒的复制能力 1Carman WF, London: Churchill Livingstone, 1998;141-172 1Carman WF, London: Churchill Livingstone, 1998;141-172

变异株 ≠ 突变株 （variant）（mutant） HBV变异株 是指在自然环境中发生变化的病毒株 HBV基因型、HBsAg血清型和亚型 HBV突变株 是指在宿主体内自发产生或者在治疗压力或其它压力下发生改变的病毒株 HBV自发性前核心区/核心区和核心启动子(BCP)突变与HBV基因型密切相关 HBV变异株包括HBV基因型、HBsAg血清型和亚型以及自然发生的表面抗原突变体。 尽管HBV变异株是在自然环境中自发变化，但是仍需与HBV突变株进行鉴别，后者是指在野生株（wt）HBV感染的过程中在宿主体内发生了变化。 此外，在HBV感染过程中，对自发性前核心区/核心区和基础核心启动子(BCP)突变HBV的选择，与HBV基因型密切相关。 1Lok AS, Gastroenterology, 2001; 120:1828-1853 1Lok AS, Gastroenterology, 2001; 120:1828-1853

病毒感染的持久性及耐药性 病 毒 肝细胞 宿 主 病毒高复制 高变异率 病毒多聚酶 缺乏矫正功能 CCC DNA 半衰期长 受染细胞 选择性压力 免疫应答 宿 主 1Zoulim F,Semin Liver dis,2002;22S1:23-32 2Zoulim F,Antivir Chem Chemother,2001,12:131-142 对耐药突变株的选择 1Zoulim F,Semin Liver dis,2002;22S1:23-32 2Zoulim F,Antivir Chem Chemother,2001,12:131-142

耐药分析 三者相关，但不完全等同 耐药基序 （Drug resistance motifs） HBV表型耐药 （Phenotypic resistance） 临床耐药 （Clinical resistance） 三者相关，但不完全等同

Lamivudine and wild-type HBV(一) Nucleotides M ss (-) DNA high affinity D D HBV polymerase (wild-type)

Lamivudine and wild-type HBV(二) inhibition Nucleotides ss (-) DNA M high affinity D D HBV polymerase (wild-type)

Lamivudine and YMDD variant HBV weak inhibition Nucleotides V/I ss (-) DNA reduced affinity D D HBV polymerase (variant)

病毒耐药性的诊断 表型耐药－在治疗期间血清病毒DNA水平上升 基因型耐药－病毒多聚酶基因出现突变 到目前为止，如果患者在接受治疗期间其血清中的HBV DNA水平出现上升，已经足以诊断患者出现病毒耐药性。但是研发新的治疗药物，需要获得突变病毒的基因组序列以避免出现交叉耐药。因此，病毒基因组序列分析对于耐药株的诊断以及新药的研制非常重要。 目前用于基因组序列分析的检测方法有线性探针分析，DNA芯片等。 该图列出了可以引起耐药的多聚酶基因的主要突变类型。 此外，最近报道了所谓原发性耐药，是指在抗病毒治疗过程中，HBV DNA没有降至杂交检测下限以下，或者应用PCR方法检测发现HBV DNA水平没有明显降低。这种现象主要见于应用泛昔洛韦治疗的患者，而应用拉米夫定者少见。 1Nafa S, Hepatology,2000;32:1078-1088 2Stuyver L, J clin Microbiol,2000;38;702-707 1Nafa S, Hepatology,2000;32:1078-1088 2Stuyver L, J clin Microbiol,2000;38;702-707

耐药变异的检测方法 Sequences analysis Line probe assay PCR-RFLP analysis (Restriction fragment length polymorphism) Real-time PCR Molecular beacons DNA chip

LightCycler Detection Formats Mutation Analysis Mismatch Perfect Match Temperature low medium high

YMDD变异检测结果 应用Lightcycler软件对结果进行分析，不同的病毒株熔解温度有差别：野生株熔解温度最高，其次为YVDD型变异株，而YIDD型变异株最低；单一病毒株出现单峰，而两株病毒株混合出现双峰；YMDD、YVDD、YIDD的熔解温度分别为54 ℃± 1.5 ℃ 、50.5 ℃± 1.5 ℃ 、46.5 ℃± 1.5 ℃ 。

Incidence of YMDD variant HBV Incidence of detectable serum YMDD variant HBV in HBeAg+ve patients after lamivudine therapy for: 1 yr = 24% (Lai et al, 2001) 2 yr = 38% (Liaw et al, 2000) 3 yr = 49% (Leung et al, 1999) 4 yr = 67% (Chang et al, 2000) Emergence of YMDD variants does not necessarily equate to clinical resistance

YMDD变异检测结果 张欣欣等 瑞金医院 编号 治疗前 治疗48周 YMDD YIDD YVDD 变异株百分比(%) YMDD YIDD 1 17 1 1 10.5 1 23 100 2 19 3 13.6 1 18 100 3 21 2 8.7 6 11 65 4 21 20 100 5 17 3 15 20 张欣欣等 瑞金医院

YMDD变异对临床的影响 张欣欣等 瑞金医院

YMDD变异对临床的影响 张欣欣等瑞金医院

Percents of Detection of YMDD mutant in untreated patients Country Method Number of Patients Percents of Detection of YMDD mutant in untreated patients China Clone Analysis 5 80% (4/5) Japan1 PCR –ELISA & mini-sequence method 18 28% (5/18) Japan2 Peptide nucleic acid (PNA) mediated polymerase chain reaction clamping 22% (4/18) Germany Line- probe-assay 86 Of the patients who developed resistance, 32% had YMDD mutants pretreatment. Of those who did not develop resistance, 59% had YMDD mutants pretreatment. Therefore, YMDD pre-treated doesn’t predict treatment failure. Japan1: Satsuki Kobayashi, Tatsuya Ide, Michio Sata Japan2: Toshihiko Kirishima, Takeshi Okanoue, Yukiko Daimon, et al.

对拉米夫定耐药株的治疗 对拉米夫定耐药株的活性 体外 体内 抗病毒药物 耐药性 干扰素 有: 75%的患者 尚未研究 有 拉米夫定 体外 体内 抗病毒药物 耐药性 干扰素 有: 75%的患者 尚未研究 有 拉米夫定 有: 25%/1y;50%/2y 无 无 阿地福韦 无报道 有 有 恩替卡韦 无报道 部分活性 有 Emtricitabine 不明 无 不明 泛昔洛韦对拉米夫定耐药株无效 对拉米夫定停药后病毒反跳者重新应用拉米夫定可致快速耐药 1Nafa S, Hepatology,2000;32:1078-1088 2Delaney Wet, Antimicrob Agents Chemother,2001;45:1705-1713 Clevudine 不明 无 不明 LdT 不明 不明 不明 LdC 不明 不明 不明 LFd4C 不明 部分活性 不明 1Nafa S, Hepatology,2000;32:1078-1088 2Delaney Wet, Antimicrob Agents Chemother,2001;45:1705-1713

Adefovir 治疗CHB 及 对LAM耐药变异的体内外试验 2002年欧洲肝病会议信息（二）2002.4. 西班牙 Adefovir 治疗CHB 及 对LAM耐药变异的体内外试验

Inhibition of lamivudine-Resistant HBV by Adefovir in Cell Culture Assay Fold Increase in IC50 Mutation Lamivudine Adefovir Wide type 1 1 V521L 1.4 1.9 L528M 3.5 1.9 M552I 380 3.2 L528M + M552V 2080 2.5 V521L + L528M + M552V 1666 0.7 L528M & V521L: compensatory mutations enhancing replication fitness

Viral Load Suppression in Patients Treated with ADV for Up to 72 Weeks Median Decrease in Duration of ADV No. of HBV DNA Therapy patients* (Log10 c/ml ) 24 weeks 106 - 3.6 48 weeks 46 - 4.4 72 weeks 14 - 4.7 Genotyped patients with both baseline and post-treatment HBV DNA data available

对拉米夫定耐药的预防 针对病毒 针对宿主 拉米夫定+泛昔洛韦 拉米夫定+阿地福韦 (或+恩替卡韦,LdT) 拉米夫定+干扰素 (或IFN续贯治疗) 针对宿主 恢复特异性抗HBV CD4/CD8免疫应答 诱导持续病毒抑制 HBV DNA疫苗 细胞因子 拉米夫定+泛昔洛韦可以快速抑制病毒，但是对拉米夫定耐药株的作用尚未研究。 阿地福韦可以有效治疗拉米夫定耐药株，因而拉米夫定+阿地福韦可以用于野生株和耐药株混合感染的患者，拉米夫定与其它核苷类似物药物的联合尚在研究之中。 拉米夫定联合IFN或者与干扰素续贯治疗对耐药株的作用尚需进一步的独立研究。 应用HBV DNA和新的细胞因子有可能恢复特异性抗HBV CD4/CD8免疫应答，诱导持续病毒抑制，但是尚需进一步的临床试验。 1Gish RG, Antimicrob Agents Chemother, 2002;46:1734-1740 2Santantonio T, J Hepatol, 2002;36:799-804 1Gish RG, Antimicrob Agents Chemother, 2002;46:1734-1740 2Santantonio T, J Hepatol, 2002;36:799-804

患者用拉米夫定前后的病情演变 拉米夫定 100mg 男性，36岁 干扰素 HBeAg+ HBeAb- HBeAg- HBeAb+ 108 日达仙 1.6mg TIW DNA ALT 拉米夫定 100mg 干扰素 108 107 HBeAg+ HBeAb- HBeAg- HBeAb+ HBsAg- 106 105 104 103 102 男性，36岁

展望 治疗拉米夫定耐药株的新药已在临床试验之中，其中阿地福韦对拉米夫定耐药株具有较强的活性 发展新的方法确定病毒载量、检测耐药株、评估CCC DNA对监测治疗进而改变治疗终点非常重要 随着新药及新的治疗方案的出现，包括联合治疗，序贯治疗及间歇治疗，我们相信不仅可以有效治疗而且可以有效预防拉米夫定耐药株 1Gish RG, Antimicrob Agents Chemother, 2002;46:1734-1740 2Michel ML, Vaccine, 2001;19:2395-2399 1Gish RG, Antimicrob Agents Chemother, 2002;46:1734-1740 2Michel ML, Vaccine, 2001;19:2395-2399

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