实验一 真核细胞染色体DNA的 分离、纯化和检测

实 验 目 的 通过实验学习从血液中制备染色体DNA的 方法。 学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度、 DNA的构型、含量以及分子量的大小。

实 验 原 理 红细胞裂解液裂解红细胞 细胞裂解液裂解白细胞 用蛋白酶K水解蛋白质 有机溶剂酚、氯仿抽提 在高盐条件下，用乙醇沉淀DNA 再用70%乙醇洗除沉淀中的盐分 即可获得染色体DNA

实 验 原 理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。前者由分子所带净电荷量的多少而定，后者则主要与分子大小及其构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，在用电泳法测定DNA分子大小时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度的差异所决定，提高分辨率。同时适当减低电泳时的电压，也可使分子筛效应相对增加而提高分辨率。

实 验 原 理 纯净的DNA A260/A280=1.8，制备的DNA样品应该为1.7~1.8 纯净的RNA A260/A280=2.0，制备的RNA样品应该大于2.0 如果制备的DNA样品A260/A280<1.7，说明样品中含酶和蛋白质过高，应将样品用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA； A260/A280>2，说明样品中RNA过高，可用RNase消化后，用酚、氯仿、异戊醇抽提，再用乙醇沉淀DNA； 如果样品A260/A280为1.8~2.0，说明样品中盐的含量过高，样品沉淀后应用70%乙醇多洗一遍。 提取的RNA样品A260/A280应大于1.80。RNA样品含有蛋白质会使A260/A280比值下降。

实 验 材 料 红细胞裂解液 KHCO3 1g (10mM) NH4Cl 8.3g (155mM) EDTA·Na2 37mg (0.1mM) 裂解缓冲液（lysis buffer） 10mM Tris-Cl (pH8.0) 0.1M EDTA (pH8.0) 0.5%(m/v) SDS ACD抗凝液 柠檬酸 0.48g 柠檬酸钠 1.32g 右旋葡萄糖 1.47g 加水至100ml,使用时每6ml新鲜血液加1ml ACD液 组织细胞 动物血液样品，将20ml新鲜血液与3.5mlACD抗凝液混匀，0℃下保存数天或-70℃下长期冻存，备用。

实 验 材 料 酚：氯仿：异戊醇（25：4：1） 70%乙醇 TE buffer RNAse 琼脂糖 TAE电泳缓冲液 电泳设备 紫外分光光度计 凝胶成像系统

染色体DNA的制备方法 1. 将800ul抗凝储冻血液置室温溶解。 2. 往管中加2ml红细胞裂解液，轻摇数次，置冰上15分钟，期间间歇摇动 几次，看管底沉淀，悬浮沉淀。 3. 6000rpm，室温离心10分钟，弃上清。 4. 往管中加入4ml红细胞裂解液，轻摇几次后，冰上5分钟，期间摇几次， 看管底沉淀，摇动试管悬浮沉淀。 5. 6000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。 6. 重复步骤4、5，1-2遍（视红细胞洗净程度而定），至沉淀白色。 7. 用1×PBS 4ml洗涤所得沉淀，混匀，冰上5分钟，期间摇动几次。 8. 6000rpm，4℃离心5~10分钟，弃上清。 9. 每管中加入500μl白细胞裂解缓冲液，重悬细胞，加入20μl proteinase K（20mg/ml），混匀后置55℃水浴1小时，至溶液清亮（澄清）。

染色体DNA的制备方法 10. 用酚-氯仿（350μl+350μl）、氯仿（450μl）分别抽提一次，每次抽提后10000rpm，4℃离心5分钟，取上清（不要吸入有机相）。 11. 上清中加入2倍冰预冷无水乙醇和0.1倍3M NaAc。冰上20分钟或-20℃过夜。 12. 12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清。 13. 用1ml 70%乙醇洗涤沉淀1-2次，12000rpm，4℃离心5分钟，弃上清。 14. 室温干燥沉淀5分钟。 15. 加入100μl DDW（无菌水），37℃水浴至DNA溶解。 16. 取样品10μl，用0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定样品。 17. 相对完整的染色体DNA在电泳图中只出现一条分子量较大的条带，不会出现条带弥散现象。 18. 取样品10μl，稀释100倍，测A260和A280，计算DNA浓度。

琼脂糖凝胶电泳方 法 1.选择合适的电泳仪和水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与正负极的线路。 2. 将电泳板置于制胶器中或用玻璃胶带封好制胶板两端，防止浇板时出现渗漏。选择孔径大小适宜的点样梳，垂直架在电泳板负极的一端，使点样梳底部电泳板水平面的距离为0.5-1.0mm。 3. 制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。称取琼脂糖，溶解在电泳缓冲液中，大电泳槽约160毫升，小电泳槽约35毫升凝胶液，置微波炉或水浴锅中加热，至琼脂糖全部溶化。 4.待凝胶溶液冷至50℃左右时，在凝胶溶液中加入EB（终浓度0.5μg/ml），摇匀，轻轻倒入电泳板上，除去气泡。

琼脂糖凝胶电泳方 法 5．待凝胶冷却凝固后（约30分钟），在电泳槽内加入电泳缓冲液，大电泳槽约需1200ml，小电泳槽约180ml。从制胶器取出电泳板，放入电泳槽，然后小心取出点样梳，保持点样孔的完好，去除空内气泡。 6．待测的DNA样品中，加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液（6×loading Buffer）。如果待测样品太小要用电泳缓冲液稀释，再加五分之一体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液。如点样体积10μl样品与2μl溴酚蓝指示剂点样缓冲液，混匀后小心地进行点样，记录点样顺序和点样量。 7．打开电源，DNA的迁移速度与电压成正比，与琼脂糖含量有关。最高电压不超过5V/cm(大电泳槽不超过200V，小电泳槽不超过150V)。 8．电泳时间看实验的具体要求而定，在电泳途中可用紫外灯直接观察，DNA各条条带分开后，可以结束电泳。一般20分钟~2小时，取电泳凝胶块直接用凝胶成像系统成像和分析。

DNA样品的纯化和定量检测方法 1．取DNA粗制样品，加入RNase至终浓度10µg/µl，37 ℃反应0.5小时。 2．加入酚：氯仿：异戊醇（25：4：1）等体积抽提1~3次，12000 rpm，离心5分钟,取上清。 3．加入1/10倍体积3M NaAc（pH5.2），2倍体积无水乙醇混匀，室温下30~60min。 4．15000 rpm，离心10分钟。 5．DNA沉淀用冰预冷70 %乙醇洗1次，开盖37 ℃干燥10min（使乙醇挥发）。 6．加入30µl TE buffer，37 ℃水浴至沉淀溶解。 7．取10 µl DNA 1 %琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录和分析结果，估计样品DNA分子量。 8．取10 µl DNA母液稀释至1000ul，在紫外分光光度计上测A260和A280。计算样品DNA浓度，判断样品浓度和DNA纯度。

DNA制备注意事项 1. 如要11步中完整的DNA,在12步时，挑出DNA沉淀，用70% 乙醇洗涤1-2次。 2. 步骤2、4、7中要颠倒摇动试管悬浮沉淀，不可用枪头 （尤其是没剪去枪头尖端）吹打沉淀。 3. 步骤10中吸上清枪头使用前必须粗吸头（微量移液枪的 枪头剪去尖端，并用火烧一下，使之圆钝），避免机械 剪切力对DNA链的损伤。 4. 为了获得高分子量的DNA，操作中必须防止混匀、抽提及 沉淀时剧烈机械震荡造成的DNA的断裂。 5. 如含有RNA,可用100ng/ml的RNase在37℃水解半小时。对 于新血液，取ACD或EDTA抗凝，10ml全血中加3.3ml ACD 或1ml EDTA。

电泳注意事项 1. 琼脂糖的质量： 琼脂糖（agarose）是以质量较好的琼脂作原料制成的。琼脂是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羟基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质将给电泳带来电渗作用的不良影响，因而必须去除干净。所谓琼脂糖的质量不过关就是琼脂糖内含有较高比例的琼脂胶。琼脂糖是一种直链多糖，它由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线性多聚糖。由于链状琼脂糖分子相互以氢键交联，因此与琼脂一样能形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基因，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。

电泳注意事项 2. DNA分子的迁移率： 影响DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。为了精确测定其分子量的大小，采用一下措施： (1) 每次测定时，要有已知分子量的DNA片段作为标准， 进行对照。电泳。 (2) 选择最合适的电泳条件。 (3) 提高分子筛效应，降低电荷效应。

电泳注意事项 3. EB染色：EB是核酸的显色剂，使用EB对DNA染色的3种方法： (1) 在制胶中与电泳缓冲液中同时加入EB。 (3) 在电泳结束后，取出凝胶，放在含有EB的电泳缓冲液或DDW中浸染10-30分钟。 4．溴酚蓝指示剂缓冲溶液的作用：含有50%蔗糖，可增加上样DNA溶液的密度，以确保DNA样品沉入点样孔内，起DNA电泳时的前沿指示剂作用。一般溴酚蓝的电泳迁移位置相当于300~400bp双链线状DNA。 5．点样量太高易产生拖尾与弥散现象，样品迁移速度减慢。点样量太少，分辨不清，影响结果。 6．EB为强诱变剂，剧毒，操作时要带一次性手套，并在专区间操作。用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让有EB的面朝里，有EB的废液和器皿不能随便丢弃，要用专门方法处理后丢弃。

DNA定量检测注意事项 测定光吸收值时，用稀释DNA样品的溶液做对照。 选择稀释要适当，应在检测范围之内。

思 考 题 实验中影响染色体DNA完整的因素有哪些？如何 减少这些因素对完整性的影响？ 如何判断提取的染色体DNA样品的质量？ 思 考 题 实验中影响染色体DNA完整的因素有哪些？如何 减少这些因素对完整性的影响？ 如何判断提取的染色体DNA样品的质量？ 为了获得清晰的DNA样品电泳图，在琼脂糖凝 胶电泳过程中应该注意哪些问题？ 如何选择测量DNA的合适的稀释倍数？ 为什么需要对DNA进行纯化？