DNA Biosynthesis，Replication 第 十 章 DNA的生物合成 (复制) DNA Biosynthesis，Replication

Central Dogma 描述遗传信息流动的方向 1958年 F.crick 逆转录酶 1970年 对中心法则进行了补充

复制(replication) 是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。 复制 子代DNA 亲代DNA

Basic Rules of DNA Replication 第一节 复制的基本规律 Basic Rules of DNA Replication

一、半保留复制的实验依据和意义 子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式 半保留式 混合式

密度梯度实验

半保留复制的概念 DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。

半保留复制的意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。

二、双向复制 原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。 复制中的放射自显影图象

C. 复制接近终止点(termination, ter) ori ter A B C A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉 C. 复制接近终止点(termination, ter)

真核生物 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。 习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。

5’ 3’ ori 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 复制子

三、复制的半不连续性 3 5 解链方向 3´ 5´ 领头链 (leading strand) 随从链 (lagging strand)

顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

The Enzymology of DNA Replication 第二节 DNA复制的酶学 The Enzymology of DNA Replication

参与DNA复制的物质 底物(substrate): dNTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶， 简写为 DNA-pol 模板(template) : 解开成单链的DNA母链(ssDNA） 引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子

一、复制的化学反应 (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi

聚合反应的特点 DNA 新链生成需引物和模板； 新链的延长只可沿5 → 3方向进行 。

二、DNA聚合酶 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase,DDDP) 活性：1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性

? 核酸外切酶活性 3  5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5  3外切酶活性 能切除突变的 DNA片段。 5´ A G C T T C A G G A T A  3´ | | | | | | | | | | | 3´ T C G A A G T C C T A G C G A C 5´ ? 3  5外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5  3外切酶活性 能切除突变的 DNA片段。

（一）原核生物的DNA聚合酶 DNA-pol Ⅰ DNA-pol Ⅱ DNA-pol Ⅲ

DNA-pol Ⅰ （109kD） 复制产生短片断的DNA 功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。

N 端 DNA-pol Ⅰ C 端 木瓜蛋白酶 小片段 大片段/Klenow 片段 323个氨基酸 604个氨基酸 5  核酸外切酶活性 DNA聚合酶活性   5 核酸外切酶活性 Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-pol Ⅱ（120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 它参与DNA损伤的应急状态修复。

DNA-pol Ⅲ (250kD) 复制产生长片断的DNA 功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

（二）真核生物的DNA聚合酶 DNA-pol  起始引发，有引物酶活性。 DNA-pol  参与低保真度的复制 。 DNA-pol  延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 DNA-pol  在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。

三、复制保真性的酶学依据 复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。 复制保真性的酶学机制： （一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和碱基选择

（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读

A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。

（二）复制的保真性和碱基选择 • DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 • 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。

DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能； 3. 复制出错时DNA-pol的及时校读功能。

四、复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。

（一）解螺旋酶和单链DNA结合蛋白

解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解 开成为两条单链 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA引物的酶

单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整

（二）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 10 8 局部解链 解链过程中 正超螺旋的形成

拓扑异构酶作用特点 既能水解 、又能连接磷酸二酯键 分 类 拓扑异构酶Ⅰ 拓扑异构酶Ⅱ

作用机制 切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。 拓扑异构酶Ⅰ 反应不需ATP。 利用ATP供能，连接断端， DNA分子进入负超螺旋状态。 拓扑异构酶Ⅱ

五、DNA连接酶 DNA连接酶(DNA ligase)作用方式 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。

5’ 3’ 3’ HO 5’ ATP DNA连接酶 ADP 5’ 3’ 3’ 5’

功能 DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 也是基因工程的重要工具酶之一。

一、原核生物的DNA生物合成 （一）复制的起始 需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。 2. 合成引物，提供3-OH末端。

1. DNA解链 1）复制起始点的识别 串联重复序列 反向重复序列 5 3 E.coli复制起始点 oriC GATTNTTTATTT ··· GATCTNTTNTATT ··· GATCTCTTATTAG ··· 113 17 29 32 44 串联重复序列 反向重复序列 5 3 ···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 245 E.coli复制起始点 oriC

3） DNA拓扑异构酶(可能主要是II型酶的作用)，在将要打结或已打结处作切口。 2）解螺旋酶解开双链 3） DNA拓扑异构酶(可能主要是II型酶的作用)，在将要打结或已打结处作切口。 4）SSB参与维持DNA的单链结构的稳定 Dna B、 Dna C 3 Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5

2. 引发体的形成 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。 Dna B、 Dna C 3 Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

引物酶 复制是在一段RNA引物的基础上进行的，催化引物合成的是一种RNA聚合酶，它不同于催化转录过程的RNA聚合酶，因此称为引物酶。 DDRP —— DNA dependent RNA polymerase 由于DDDP不可以催化两个单dNTP之间的反应，DDRP可以催化两个NTP起始合成小的RNA片断 引物酶合成的小的RNA片断称为“引物”，为DNA的合成提供 3’－OH

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。 3 引物酶 3' HO 5' 引物 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，在电子显微镜下均看到伸展成叉状的复制现象，称为复制叉。 在DNA聚合酶III的作用下，新链第一个脱氧核苷酸就加到引物的3’-OH末端上，形成磷酸二酯键。复制开始。

（二）复制的延长 复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。

5' 3' DNA-pol 5' OH 3' 3' dATP dGTP dTTP dCTP

领头链的合成：DDDP沿着模板3’5’滑动，第一个进入配对的dNTP与RNA引物上的3’－OH形成3’,5’－磷酸二酯键，留下3’－OH继续合成

随从链的合成——岡崎片段的形成

两条链是在同一个DNA-polⅢ的催化下进行延长的过程

阶段一 阶段二

阶段三 阶段四

（三）复制的终止 ori ter 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。 E.coli SV40 82 32 SV40 50

随从链上不连续性片段的连接 5 5 RNA酶 OH P DNA-pol Ⅰ dNTP 5 P ATP ADP+Pi 5 DNA连接酶

复制过程简图

二、真核生物的DNA生物合成 G2 S G1 哺乳动物的细胞周期 M DNA合成期 • 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。 • 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。

（一）复制的起始 • 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。 • 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 • 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。

（二）复制的延长 3 5 亲代DNA 领头链 5 3 5 3 随从链 3 引物 5 核小体

（三）复制的终止 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。

5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 + 5 3 3

端粒(telomere)是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。 结构特点 • 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 • 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基的短序列。 TTTTGGGGTTTTGGGG…

功能 • 维持染色体的稳定性 • 维持DNA复制的完整性

端粒酶(telomerase) 组成 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT)

端粒酶的催化延长作用 爬行模型

DNA聚合酶复制子链 进一步加工

端粒维持着染色体的稳定。端粒因细胞分裂而变短到一定程度时，细胞就会死亡。 端粒破损会导致DNA变得脆弱、容易发生变异，可能导致一些与衰老有关的疾病，如动脉硬化和某些癌症。

Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways 第四节 逆转录和其他复制方式 Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways

一、逆转录病毒和逆转录酶 RNA DNA 逆转录(reverse transcription) 逆转录酶(reverse transcriptase) RNA DNA 逆转录酶

逆转录病毒细胞内的逆转录现象 RNA 模板 逆转录酶有三种酶的活性：RNA或DNA作模板的dNTP聚合酶活性和RNase活性 DNA-RNA 杂化双链 逆转录酶有三种酶的活性：RNA或DNA作模板的dNTP聚合酶活性和RNase活性 RNA酶 单链DNA 逆转录酶 双链DNA

试管内合成cDNA cDNA complementary DNA 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 AAAA cDNA complementary DNA 逆转录酶 A A A A T T T T 以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。 碱水解 T T T T DNA聚合酶Ⅰ 分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。 SI核酸酶

RNA 模板 反转录病毒细胞内的复制 DNA-RNA 杂化双链 单链DNA 双链DNA 宿主DNA 逆转录酶 在某些条件下，前病毒的基因组通过基因重组，参加到细胞基因组内，并且随着宿主的基因一起复制和表达——整合 前病毒独立繁殖或者整合，都可成为致病的原因 RNA酶 单链DNA 逆转录酶 双链DNA 整合 宿主DNA

二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。 对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

三、滚环复制和D环复制 滚环复制(rolling circle replication) 是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。

3-OH 5-P  5 3 5 3 5' 5 3 3 5 3 5' 3 5 滚环复制

D环复制(D-loop replication) 是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。 dNTP DNA-pol γ

DNA Damage (Mutation) and Repair 第五节 DNA损伤（突变）与修复 DNA Damage (Mutation) and Repair

遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。 从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。 在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。

一、突变的意义 （一）突变是进化、分化的分子基础 （二）突变导致基因型改变 （三）突变导致死亡 （四）突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素 UV 物理因素:紫外线(ultra violet, UV)、各种辐射 紫外线照射可引起核酸链上相邻的两个胸腺嘧啶形成二聚体TT（胸腺二聚体）。

化学因素

三、突变的分子改变类型

错配 (mismatch) 缺失 (deletion) 插入 (insertion) 重排 (rearrangement) 框移 (frame-shift)

（一）错配 1. 转换 DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。 发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换

N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · · · C 肽链 正常成人Hb (HbA)β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · glu · glu · · · · · · C 肽链 CTC GAG 基因 镰形红细胞贫血病人Hb (HbS) β亚基 N-val · his · leu · thr · pro · val · glu · · · · · · C 肽链 CAC GTG 基因

（二）缺失、插入和框移 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。 插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。 缺失或插入都可导致框移突变。 框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。

缺失引起框移突变 正常 缺失C 5’ ……G C A G U A C A U G U C …… 丙 缬 组 缬 谷 酪 蛋 丝 5’ ……G C A G U A C A U G U C …… 丙 缬 组 缬 正常 5’ ……G A G U A C A U G U C …… 缺失C

（三）重排 DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

由基因重排引起的两种地中海贫血基因型

四、DNA损伤的修复 修复(repairing) 修复的主要类型 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。 光修复(light repairing) 切除修复(excision repairing) 重组修复(recombination repairing) SOS修复

（一）光修复 UV 光修复酶(photolyase) 光修复过程是通过光修复酶催化而完成的，需300－600nm波长照射激活

（二）切除修复 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 E.coli的切除修复机制 UvrA UvrB UvrC 是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。 OH P DNA聚合酶Ⅰ OH P E.coli的切除修复机制 DNA连接酶 ATP

（三）重组修复 (recombination repairing) 这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。

（四）SOS修复 DNA分子受到较大范围损伤,使复制受到抑制时这种修复机制用SOS借喻细胞处于危急状态。  损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。继续催化损伤部位DNA的复制。  通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。