SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）及蛋白质免疫印迹分析 Polyacrylamid Gel Electrophoresis

蛋白质的SDS-PAGE：将蛋白质按照分子量大小在电场中将其区分开的过程 Electrophoresis:带电粒子在电场中的定向移动。 电泳需要一定的介质：琼脂糖、聚丙烯酰氨 1,载体 2,分子筛效应，孔径要合适，合适的孔径是一个相对的概念 影响分子移动的因素 1,动力：电荷数、电场强弱 2, 阻力：分子与介质间的摩擦力 分子量 构象

SDS-PAGE的介质 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N-四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称PAGE)。

实验原理 SDS-PAGE：是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）。 处理样品时加入强还原剂（ β 巯基乙醇）强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂。 蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，

由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此蛋白质最终所携带的电荷数与其分子量成正比。 蛋白质的高级结构均已打开，分子大小也与其分子量成正比。 因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子量。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

反应凝胶孔径的指标： 胶浓度（T）：所用丙烯酰胺和双丙稀酰胺的总的百分浓度，一般根据所需分离的范围选择浓度。 交连度(C)：即双丙烯酰胺占丙稀酰胺总计的质量比。孔径随着二者比率的增大而减小，比率接近1:20，孔径达到最小值。一般实验常用比率为1:29。可分离大小相差3％的多肽。

分子量范围与凝胶浓度的关系 104 20-30 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 1-4×104 15-20 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 104 20-30 1-4×104 15-20 1-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 5×105 2-5 分子量范围与凝胶浓度的关系

SDS-PAGE的装置

SDS-PAGE分为连续与不连续两种系统 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。

1.4 不连续体系的凝胶有浓缩胶及分离胶所组成 浓缩胶是浓度低大孔胶，凝胶缓冲液为pH 6.8的Tris-HC1。 分离胶是浓度高的小孔胶，凝胶缓冲液为pH 8.8 Tris-HC1。 电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

实验试剂 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4℃贮存可用1-2月。 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。 （4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。 （5）10%过硫酸铵(AP) （6）TEMED（四甲基乙二胺） （7）2X样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至10ml。

实验试剂 （11）染色液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。 考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述溶液液 250ml， 过滤后备用。 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。 （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

各部分凝胶配制

实验过程 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干净的烧杯. 2.把玻璃板在灌胶支架上固定好. ※固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板. 3.按比例配好分离胶,用注射器快速加入,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水,静置25分钟左右，温育可加速胶连。. ※凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.

实验过程 . ※水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡 ※凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面. 4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处,迅速插入样梳,静置40分钟. ※样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.

实验过程 5.拔出样梳后,在上槽内加入缓冲液,没过锯齿时可拆去 底端的琼脂糖. ※要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 6、样品的处理： （1）取10µl标准蛋白溶解液于EP管内，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量为20µl。 （2）取10µl样品溶液，再加入10µl 2倍样品缓冲液，上样量分别为20µl。 （3）沸水浴3min 7.用微量注射器距槽底三分之一处进样,加样前,样品在 ※注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下 沉时会发生扩散. ※为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.

实验过程 8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在10mA，当进入分离胶后改为20mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时左右。 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 ※剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分. . 11.实验结果分析。

低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 SDS-PAGE 可以使我们获得什么信息？

Western Blot 1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上 1 原理： 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上 然后与能特异性的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体. 加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体. 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。

2 操作过程 SDS-PAGE 转膜（硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影 封闭 一抗 洗涤 酶标二抗反应 洗涤 显色或化学发光显影 一抗是针对目标蛋白的特异性抗体 二抗是针对一抗的种属来源的 为什么要有二抗？

Membrane Transfer From gel to membrane 一、虹吸转移

Vacuum Transfer（真空转移）

Electrophoretic Transfer（电转移）

（2）转膜 戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致 以适量的转移Buffer室温平衡滤纸、凝胶和膜15－30min， 方向正确：凝胶在阴极，膜在阳极 排去滤纸、胶和膜间的气泡。 电转时间：30V ，过夜,可根据蛋白分子量的大小灵活 选择 转移结束后，膜用氨基黑染色观察蛋白分子量标准的位置

（3）封闭 用5％脱脂奶粉或3％BSA （含0.1％Tween20 TBS或PBS配制） 时间：室温2h或4ºC过夜

（4）显色或显影 化学发光显影 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 显色（根据二抗上的标记物不同进行选择） 辣根过氧化物酶：底物为DAB 碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT 化学发光显影 最常用。辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）

Western Blot Southern Blot Northern Blot