免疫学诊断与防治 海南医学院微生物学与免疫学教研室制作 Copyright 2009

免疫学诊断 一、抗原或抗体的检测 二、淋巴细胞的测定 三、免疫学检测方法的应用

一、抗原或抗体的检测 （一）抗原抗体反应的原理 1、抗原抗体反应的 特异性 （1）特异性 （2）可逆性 亲和力（affimity）与亲合力（avidity） ——抗体抗原之间的结合力大小。 结合力大则亲和力强 ，不易解离，反之则然。 （3）适宜的条件 2、抗原抗体反应的可见性 抗原抗体按适当比例结合，形成肉眼可见的现象。 免疫学诊断

应 用 1、利用已知抗原检测未知抗体 （1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。 应 用 1、利用已知抗原检测未知抗体 （1）检测病原微生物的相应抗体以辅助诊断疾病： 伤寒病、流行性乙型脑炎、AIDS病等。 （2）检测自身抗体——诊断自身免疫病：SLE、类风湿性关节炎等 2、利用已知抗体检测未知抗原 （1）鉴定病原菌：诊断疾病 （2）检测肿瘤相关抗原：检测甲胎蛋白以诊断肝癌 （3）检测血型抗原、HLA抗原：鉴定血型，亲子鉴定 （4）检测药物半抗原： 确认运动员是否服用兴奋剂

（二） 抗原或抗体的检测方法 凝集反应 沉淀反应 补体参与的抗原抗体反应 免疫标记技术

（一）凝集反应（agglutination） 颗粒性抗原（红细胞、细菌、 乳胶颗粒等）与抗体特异性结合，形成肉眼可见的凝集块。 1 、直接凝集(direct agglutination) 玻片凝集、试管凝集 2、间接凝集（indirect agglutination） 可溶性抗原包被在乳胶颗粒或红细胞表面，与相应 抗 体混合出现的凝集现象。 3、抗球蛋白试验（Coombs试验） 抗原与单价抗体（不完全抗体）结合不出现凝集块，再加入抗球蛋白后即形成凝集块。 用于检测抗Rh抗体以诊断新生儿溶血性贫血。

直接凝集

直接凝集 间接凝集 红细胞 乳胶颗粒 类风湿因子检测 妊娠试验

（二）沉淀反应（precipitation） 可溶性抗原（免疫球蛋白、细胞裂解物、组织浸液等）与相应抗体结合， 形成不溶性免疫复合物，出现不透明的沉淀物。多在半固体琼脂凝胶上进行，形成白色的沉淀。 1、单向免疫扩散（single immunodiffusion）：常用于测定IgG、IgM、IgA、C3、C4等。 抗体混于琼脂凝胶中制板 沉淀环 环的直径与抗原含量成正相关

2、双向免疫扩散（doule immunodiffusion）：常用于抗原或抗体的定性检测、组成和两种抗原相关性分析。 一致 不一致，有多种成分 部分一致

3、免疫电泳（immunoelectrophoresis） 常用于血清蛋白种类分析，以观察Ig的异常增多或缺失。如骨髓瘤及性联低丙种球蛋白血症的诊断

4、免疫比浊法（immunonephelomtry）：快速简便。用于血清IgG、IgA、IgM、 补体C3、C4含量测定

（三）补体参与的抗原抗体反应 试验原理？ 1、50 %补体溶血试验（CH50测定） ——血清总补体量测定 2、补体结合试验(complement fixation test)：检测抗原或抗体。 原理：用已知的指示系统检测试验系统是否结合补体进行诊断 检测系统：待测样品和已知抗原（或抗体） 指示系统：SRBC和溶血素 补体 溶血—阴性；不溶血—阳性

（四）免疫标记技术 用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性 荧光素 ：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、 罗丹明（红色荧光） 放射性同位素： 125I、131I 酶：辣根过氧化物酶、硷性磷酸酶 酶免疫检测法（EIA） 免疫荧光检测法（IFA） 放射免疫检测法（RIA） 液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）

间接荧光法 直接荧光法

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA法） 双抗夹心法

BAS-ELISA法（ biotin-avidin-system，生物素-抗生物素系统-ELISA法）：敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。 卵白及某些微生物中的蛋白质

用于效应细胞分泌的单一细胞因子的测定，也可测定分泌特异抗体的B细胞的频数。 （1） （2） 抗原包被 抗细胞因子的抗体包被 （3） （4） 用于效应细胞分泌的单一细胞因子的测定，也可测定分泌特异抗体的B细胞的频数。

放射免疫检测法（RIA）：灵敏度达pg水平。常用于微量物质测定，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛等药物以及IgE等。

能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量，常用于检测多种病毒的抗体或抗原，如抗HIV抗体的检测。

二、淋巴细胞的测定 （一）淋巴细胞的分离与类型鉴定 1、淋巴细胞的分离：外周血葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法 单核细胞 吸附分离 白膜层 B 过尼龙毛柱分离 T

（1）间接免疫荧光法：鉴定细胞的群、亚群。 2、淋巴细胞的类型鉴定：淋巴细胞表面标记检测、 记数 （1）间接免疫荧光法：鉴定细胞的群、亚群。 用CD3、CD4、CD8单克隆抗体检测患者外周血T细胞表面相应抗原 CD3+ ——T细胞，计算T细胞总数。 CD4+ —— CD4+T细胞，计算CD4+T细胞数。 CD8+——CD8+ T细胞，计算 CD8+亚群T细胞数 计算CD4+ / CD8+比例 正常人PMB中T细胞占65~75% CD4+ / CD8+约为1.5~2 用mIgM、mIgD单克隆抗体检测患者外周血B细胞表面相应的抗原已检测B细胞的数量 正常人外周血中SmIg+ 细胞占8~12% （2）磁珠分离法：用抗CD4交联的微珠可将T细胞 中的CD4+T细胞与CD8+T细胞分开。 （3）流式细胞术（flow cytometry）

流式细胞仪

（二）淋巴细胞功能测定 1、T细胞功能测定 （1）T细胞增殖试验（淋转）：丝裂原、抗CD3单克隆抗体 巴母细胞转化率（正常值65~80%） 。 ①形态学观察法 ②3H-TdR渗入法：用液体闪烁仪测定样品的β射线放射活性 ③MTT法 （2）淋巴细胞介导的细胞毒试验（LMC） ——检测CTL、NK、 LAK、TIL细胞杀伤靶细胞的功能

①51Cr释放法 ②凋亡细胞检查法：TUNEL法（TdT dependent dUTP-biotin nick end labeling）、FACS测定法 （3）细胞因子检测：鉴定分离的淋巴细胞亚群，监测某些疾病状态的细胞免疫功能。IL-2、IL-2R、rIFN 、TNF等检测 ①ELISA法 ②生物活性测定法 ③聚合酶链反应（PCR）法

2、B细胞功能测定 （1）B细胞增殖试验：LPS、SPA刺激，检查抗体形成细胞 的数目 （2）抗体形成细胞测定—— 溶血空斑试验 （hemolytic forming cell assay，HFC）计算HFU/ml （3）ELISPOT法检查特异抗体形成细胞

3、体内免疫细胞功能测定：皮肤试验 （1）迟发型超敏反应：旧结核菌素试验（ OT试验 ） 皮试（+）——有一定的细胞免疫能力 皮试（—）——细胞免疫功能缺损 （2）速发型超敏反应：青霉素皮试、 异种血清皮试

免疫治疗(immunotherapy) 针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能 以达到治疗疾病的治疗方法称之。 免疫调节（immunomodulation） 利用物理、化学和生物学的手段来调节机体的免疫功能，使原有的免疫功能增强或减弱。 免疫重建(immunoreconstitution) 将免疫功能正常个体的造血干细胞或淋巴细胞移植给患有免疫功能缺陷的个体，使后者的免疫功能全部或部分得到恢复。

分类 一、免疫增强疗法和免疫抑制疗法 二、特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗 三、主动免疫治疗（active immunotherapy）和被动免疫治疗（passive immunotherapy）

抗体为基础的免疫治疗 一、免疫血清 1、抗毒素血清：用于治疗和紧急预防外毒素所致的疾病，如白喉抗毒素、破伤风抗毒素。 2、胎盘（丙种）球蛋白：用于被动预防传染病、治疗丙种球蛋白缺乏症。 3、抗菌免疫血清：效果不显著 4、抗病毒免疫血清：预防病毒感染 5、抗淋巴细胞丙种球蛋白：抑制淋巴细胞。用于防止器官移植排斥反应及自身免疫性疾病的治疗。

二、单克隆抗体（mAb） 1、抗细胞表面分子的单克隆抗体：抗CD3单抗可用于治 疗急性移植排斥反应，防止GVHD的发生 2、抗细胞因子的单克隆抗体：抗IL-1、抗TNF单抗可减 轻炎症反应，用于治疗类风湿性关节炎等慢性炎症 性疾病。 3、抗体导向药物治疗（靶向治疗）：用特异性单抗作为 载体装载化学药物（阿霉素、氨甲蝶呤等）、毒素 （蓖麻毒素等植物毒素、白喉毒素等细菌毒素）、同位 素（131I、125I、111In）等细胞毒性物质，将其靶向性地 携至肿瘤病灶局部，可较特异性地杀伤肿瘤，减少副作用。

三、基因工程抗体：降低抗体的免疫原性 1、嵌合抗体（chimeric antibody） 2、人源化抗体 3、完全人源化抗体 4、单链抗体、双价抗体、双特异性抗体

抗原为基础的免疫治疗 疫苗 1、抗原以表位的形式进行免疫治疗：将表位多肽与载体结合作为疫苗 2、抗原以分子或片段的形式进行免疫治疗：表面抗原疫苗、核酸疫苗或DNA疫苗、瘤苗（活瘤苗、减毒或灭活的瘤苗、异构的瘤苗、基因修饰的瘤苗、抗独特型抗体瘤苗、分子瘤苗等。

细胞因子及其拮抗剂为基础的免疫治疗 1、细胞因子补充和添加疗法：重组的细胞因子作为免疫应答调变剂（BRM）治疗肿瘤、感染、造血障碍等。如干扰素、IL-2、TNF、CSF、EPO等 2、细胞因子阻断和拮抗疗法：治疗自身免疫性疾病、移植排斥、感染性休克等。如TNF单抗、IL-1R拮抗剂等。 3、细胞因子基因疗法：细胞因子基因转染技术

细胞为基础的免疫治疗 1、骨髓移植 （1）自体骨髓移植 （2）异体骨髓移植 （3）脐血干细胞移植 2、免疫效应细胞 （1）同种淋巴细胞被动转移：注意配型 （2）自体免疫效应细胞过继免疫疗法

LAK（lymphokine activated killer cells）细胞——淋巴因子活化的杀伤细胞。是将外周血淋巴细胞在体外经过IL-2培养后诱导产生的一种新型的杀伤细胞，具有更强的杀瘤特性。其杀伤肿瘤细胞不需抗原致敏且无MHC限制性。主要为NK细胞 TIL(tumorinfiltrating lymphocytes)细胞——肿瘤侵润淋巴细胞。是从实体瘤组织中分离得到的，经体外IL-2培养后获得比LAK细胞更强的杀伤活性。 CIK（cytokin inductive killer cells）——细胞因子诱导的杀伤细胞。是以抗CD3mAb活化，并以IL-2、TNF-γ及TNF-α等组合的细胞因子。支持外周血单个核细胞增殖并分化为CD3+CD56+杀伤细胞，具有比LAK更强的杀伤活性。

免疫增强剂与免疫抑制剂 （一）免疫增强剂 免疫因子：1、转移因子 2、免疫核糖核酸 3、胸腺肽 化学制剂：1、左旋咪唑 2、西咪替丁 微生物制剂：1、卡介苗（BCG） 2、短小棒状杆菌 3、微生物提取物 中药制剂： 黄芪、人参、枸杞子等

免疫增强药物的适应症和副作用 适应症：免疫功能低下的患者 （1）恶性肿瘤 （2）免疫缺陷病 （3）传染病 副作用：较轻

二、 免疫抑制剂 化学制剂 1、烷化剂：环磷酰胺 2、抗代谢药：激素：糖皮质激素 真菌代谢产物 1、 环孢素A：对T，尤其是TH有较好的选择 性抑制作用 2、FK-506： 其作用强于环孢素A10-100倍， 且与环孢素A有明 显的协同作用。 中药及其有效成分 雷公藤多甙

免疫抑制药物的适应症和副作用 适应症：免疫功能过高引起机体损害的患者 1、抗移植排斥 副作用：明显 2、超敏反应性疾病：激素 3、自身免疫病：激素、雷公藤多甙 4、感染性炎症：激素 副作用：明显 主要是骨髓抑制、肝肾毒性等 其抑制作用是非特异性的 长期应用可导致：继发性免疫缺陷 严重感染 肿瘤

免疫预防

一、人工免疫 （一）人工主动免疫（artificial active immunization）——用疫苗、类毒素接种机体，使之产生特异性的免疫，从而预防感染的措施。 疫苗 ——应用微生物制备的具有免疫原性的物质。包括灭活疫苗（死疫苗）和减毒活疫苗。如 麻疹疫苗，脊髓灰质炎疫苗，乙肝疫苗等。 类毒素——将细菌毒素用甲醛减毒后制备的具有免疫 原性的物质。如喉类毒素，破伤风类毒素。 （二）人工被动免疫（ artificial passive immunization ）——是给人体注射含特异性抗体的免疫血清或细胞因子等制剂，以治疗或紧急预防感染的措施。如抗毒素、人免疫球蛋白制剂、细胞因子制剂、单抗制剂等。 （三）计划免疫

Production of an attenuated organism 减毒活疫苗 Production of an attenuated organism Mutate virulence gene Pathogenic virus Delete virulence gene Isolate virulence gene

Production of a toxoid from a pathogenic toxin 类毒素 Production of a toxoid from a pathogenic toxin Chemical Pathogenic Toxoid Exotoxin modification Site related to Antigenic pathogenicity determinants

Example for a DNA vaccine 二、新型疫苗的发展 Example for a DNA vaccine A B C D control DNA Clone gene for influenza Inject cloned gene Infect mouse with haemagglutinin into a plasmid into muscle tissue influenza virus Measure virus titre

Vaccinia virus recombinants 重组病毒疫苗 Vaccinia virus recombinants Vaccinia virus Foreign gene DNA Foreign gene Ligation Transfection Infection TK gene Vaccinia promoter Tissue culture cells Homologous recombination Antibiotic BUdR selection resistance marker Foreign gene TK-negative recombinant virus

三、疫苗的应用 1、抗感染 2、抗肿瘤 3、计划生育 4、防止免疫病理损伤