细胞信号通路检测（二） Western Blot 病理生理学教研室 1

定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法

Western Blot定义 Western Blot 应用： 研究检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中特异蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究 3

Western Blot实验流程 Step1 蛋白提取 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE Step4 转膜

PBS冲洗细胞(我们采用的细胞是E0771)3次（此步骤我们省略） 步骤一、蛋白样品的提取 总蛋白抽提程序：  PBS冲洗细胞(我们采用的细胞是E0771)3次（此步骤我们省略） 加入裂解缓冲液（RIPA其中我们已加入PMSF）80ul（1.5*106个细胞大约加入100ul裂解液，或100ml培养皿中加入100ul裂解液），冰上放置20-30min 收集裂解液到EP管中 4度离心，12000转/分，2-10min 吸取上清，蛋白定量（实验条件所限我们不做），分装（也不做，直接用总体积上清即80ul与5X上样缓冲液20ul混合），加入5X上样缓冲液20ul，煮沸5-10min，保存在-80度备用。

步骤二、SDS-PAGE电泳 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。

PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。

SDS SDS与蛋白结合后，还可引起构象改变，复合物呈长椭 圆棒，SDS-PAGE只取决于蛋白分子量大小。

SDS-PAGE凝胶成分 O ∥ CH2=CH–C–NH2 O O ∥ ∥ CH2=CH–C–NH–CH2–NH–C–CH=CH2 SDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 丙烯酰胺 (A)：形成聚合物链  N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (B) ：形成纵向架桥（cross-linkage） 过硫酸铵(APS) ：助凝剂 TEMED：催化剂 ︱ CONH2 CONH2 CONH ︱ ︱ ︱ –CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH2–CH–CH– CONH CH2 CONH CONH2 CONH2 ︱ ︱ ︱ O ∥ CH2=CH–C–NH2 APS, TEMED A O O ∥ ∥ CH2=CH–C–NH–CH2–NH–C–CH=CH2 B (神经毒性) 9

制胶 不连续系统 浓缩胶 分离胶 蛋白质在进入分离胶以前，先被浓缩成一条细线，使每个蛋白的起跑线相同，提高解析度。 特点： pH不连续 凝胶不连续 缓冲液成分不连续 特点： 蛋白质在进入分离胶以前，先被浓缩成一条细线，使每个蛋白的起跑线相同，提高解析度。 10

制胶 12%分离胶(15ml) 双蒸水 4.8ml 30% Arc/Bis 6ml 分离胶缓冲液 (pH8.8) 4ml 10% SDS 150ul 10%APS 75ul TEMED 8ul 灌胶，待凝，约1小时

灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%

4%浓缩胶（7.5ml） 双蒸水 4.55ml 30% Arc/Bis 1ml 分离胶缓冲液 (pH6.8) 1.9ml 10% SDS 75ul 10%AP 75ul TEMED 7.5ul 灌胶，插梳子，待凝，约0.5小时

灌制积层胶 插入梳子

SDS-PAGE 电泳 上样前煮沸样品 上样量：30-100 μg 蛋白Marker 16

准备样本 加2×Loading Buffer,混匀，煮沸3～5分钟， 10000g离心10分钟 取上清适量上样 电泳：5mA/胶 大约需时2小时

蛋白样品的变性 SDS-PAGE上样缓冲液： DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。 按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。 100mM Tris-HCl(pH6.8) 200mM DTT 4%SDS 0.2%溴酚兰 20%甘油 ddH2O 1M Tris-HCl(pH6.8) 10 ml 1M DTT 20 ml SDS 4 g 甘油 溴酚蓝 0.2 g 总体积 100ml

步骤四、转膜 膜的选择： NC、PVDF、尼龙膜 转膜方法： 半干转、湿转 转膜确认： 立春红染色、蛋白预染Marker 3 19

取出一块胶做考马斯亮兰染色 另一块胶转膜 转膜：负极到正极，依次放海绵，滤纸，凝胶，硝酸纤维膜， 滤纸，海绵 380mA 30分钟

湿转系统

转移操作 白色夹板（正极） 垫片 300mA 1h 2层滤纸 膜（左上角标记） 凝胶（Marker靠左） 2层滤纸 垫片 +阳极 -阴极 多孔垫片 滤纸 凝胶 膜 垫片 300mA 1h 2层滤纸 膜（左上角标记） 凝胶（Marker靠左） 2层滤纸 垫片 56mA /膜 1h 黑色夹板（负极） 22

步骤五、封 闭 去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 h 23

封闭 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。

步骤六、抗体孵育 一抗的选择 ： 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的， 确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。 抗体选择： 单克隆抗体 或者 多克隆抗体 直接标记的抗体 或者 未标记的抗体 抗体的实验目的：对不同实验选用不同抗体 WB（免疫印迹）、IHC（免疫组化）、ELISA（酶联免疫反应）、FC（流式细胞检测）、 IP（免疫沉淀） 抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数. 25

二抗的选择： 根据标记物： 根据一抗物种： 抗小鼠 抗兔 抗大鼠 抗人 抗山羊 抗鸡 抗豚鼠 抗马 标记物 HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记

一抗、二抗孵育 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 回收二抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。

二抗与底物反应显色 步骤七、检测方法 化学发光法： 化学显色法： 常用HRP酶标系统的显色底物为ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快；特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。 化学显色法： 常用酶标系统HRP的显色底物为TMB和DAB 酶标系统AP的显色底物为BCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。 28

Western Blot Perfect Data Step1 蛋白样品制备 Step2 蛋白定量 Step3 SDS-PAGE 29

讨论 根据实验结果判断相关信号通路活化情况，并作出讨论